Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

резиновой трубкой. Фильтр для стерилизации воздуха обычно используют 2—3 раза, после чего его содержимое заменяют. Фильтры такого типа можно применять также для стерилизации не содержащей кислород смеси газов при культивировании анаэробов. Детальное описание устройства волокнистых фильтров для стерилизации воздуха приведено в работе [32].

Автоматическое пеногашение

Большинство перемешиваемых и аэрируемых культур во время роста образует довольно много пены. Если не препятствовать этому, пена смачивает воздушные фильтры, что приводит к заражению культуры, а также выходу пены наружу. Пеногашение осуществляют или с помощью механического пеногасителя, или путем добавления к среде химических пеногасителей. Большинство ферментеров имеет пеногасящие устройства, которые можно применять почти при любых условиях культивирования.

Химические пеногасители более дешевы; их используют время от времени при необходимости подавления пенообразования [И]. Однако при добавлении этих веществ меняется состав среды. Пеногасящие вещества растительного (кукурузное масло и масло из семян хлопчатника) и животного (свиное сало) происхождения могут использоваться микроорганизмами и тем самым вносить свой вклад в углеродный пул клеток [28]. Вместе с тем такие неметаболизируемые пеногасители, как силиконы (поставляются фирмами Dow Corning Co., Genegal Electric Corp. и Union Carbide), в высокой концентрации токсичны. Поэтому пеногасители, являющиеся поверхностно-активными веществами, следует использовать только в очень низких концентрациях и только после проверки на токсичность в каждом конкретном случае. Пеногасители добавляют непосредственно в среду перед ее стерилизацией или в ферментер через шланг в его крышке. Перед использованием пеногаситель вместе с емкостью, в которой он находится, и подающим шлангом должны быть простерилизованы. Имеются в продаже системы, обеспечивающие автоматический контроль подачи пеногасителей (New Brunswick Scientific Co., The Vir Tis Co., Chemapec Inc.).

Отбор проб и внесение инокулята

При подготовке ферментера к работе и в процессе его эксплуатации необходимо, чтобы при внесении компонентов среды и отбора проб не нарушалась стерильность и не происходило заражения ферментера микроорганизмами из внешней среды. Большинство лабораторных ферментеров оснащено трубкой для отбора проб, которая проходит через крышку ферментера и немного не доходит до его дна. При отборе проб и внесении инокулята требуется тщательное соблюдение инструкций фирмы-изготовителя. Нельзя забывать о том, что при работе ферментера должно поддерживаться положительное давление.

Культивирование в анаэробных условиях

Главным условием анаэробного культивирования в ферментерах является удаление из системы кислорода.

Прежде всего ферментер заполняют средой, насколько это максимально возможно, и в первые часы культивирования через среду продувают газ, не содержащий кислорода, поддерживая тем самым небольшое положительное давление. Использование больших объемов инокулята (10—20% объема среды) обеспечивает быстрое начало роста культуры и способствует уменьшению ее чувствительности к кислороду, попадающему из внешней среды. В случае контроля рН или добавления в среду питательных компонентов в процессе роста культуры используют максимально короткую гибкую трубку, соединяющую сосуды с ферментером, поскольку кислород способен проникать через большинство резиновых шлангов. Мало проницаемыми для кислорода считаются трубки из тайгона, но они размягчаются после автоклавиро-вания, и поэтому их можно использовать, только если предварительно укрепить с помощью проволоки. Наконец, шланг для выхода газа из ферментера следует оборудовать водной ловушкой (гидрозатвором), чтобы предотвратить обратную диффузию газа в его верхнюю часть.

Простой гидрозатвор можно изготовить самим, поместив заполненный водой мерный цилиндр или какой-нибудь другой стеклянный сосуд в перевернутом положении в водяную баню. Трубку для выхода газа из ферментера подводят под перевернутый сосуд таким образом, чтобы выходящий газ собирался в этом сосуде. Трубка должна быть кислородонепроницаемой или максимально короткой, чтобы предельно уменьшить диффузию кислорода. По мере накопления газа в сосуде вода начинает вытесняться. Для того чтобы вытесняемая вода не выливалась, сосуд с водяной баней должен быть достаточно большим. После заполнения воздухом одного сосуда его заменяют другим, заполненным водой. Объем выделяемого газа легко определить, если сосудом с трубкой для выхода газа является мерный цилиндр. При активном пропускании бескислородного газа через ферментер потребность в гидрозатворе невелика. После начала роста анаэробной культуры уже нет необходимости в интенсивном продувании газа через среду в ферментере. Однако если его подача прекращается, то необходимо немедленно установить гидрозатвор.

Рекомендуется использовать предварительно восстановленную среду; ее либо получают нагреванием в ферментере, либо вводят в ферментер, через который предварительно пропускали газ, не содержащий кислорода, уже восстановленную среду. Кислоты, основания и растворы питательных компонентов, добавляемые в ферментер в процессе культивирования, готовят и хранят в отсутствие кислорода. Полностью удалять кислород из растворов, добавляемых в ферментер в небольших количествах, необязательно, поскольку восстанавливающая способность активной анаэробной культуры достаточно велика для удаления его из таких систем.

10.2. ПРОТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ

Для непрерывного (проточного) культивирования в отличие от периодической культуры характерна постоянная подача свежих питательных компонентов со скоростью, равной скорости удаления среды из культуры (открытая система). Если культура хорошо перемешивается, то пробы, взятые из любой части ферментера, будут одинаковы по биомассе и концентрации субстрата. По составу они идентичны также культур альной жидкости, вытекающей из ферментера. При непрерывном культивировании теоретически бактерии растут экспоненциально в условиях постоянной подачи свежей среды и удаления части клеток вместе со старой средой, так что объем культуры со временем не меняется. Вообще говоря, постоянная концентрация клеток (равновесное состояние, англ. steady-state) для непрерывного культивирования не обязательна. Однако в большинстве работ по изучению количественных аспектов непрерывного культивирования описываются системы с постоянной концентрацией биомассы. Рассмотренные ниже принципы относятся только к непрерывному культивированию в равновесном состоянии.

Термин «равновесное состояние» часто употребляют в литературе в связи с непрерывным культивированием; буквально он означает, что во время исследования не происходит изменения состояния культуры. На самом деле это определение слишком широко, поскольку на практике при непрерывном культивировании некоторые параметры могут меняться, тогда как другие при этом остаются постоянными. Поэтому непрерывную культуру в равновесном состоянии определяют как культуру с постояной концентрацией биомассы в определенный период наблюдения. В противоположность этому в периодической культуре постоянная концентрация растворенного кислорода поддерживается происходящими в среде изменениями, но содержание в ней биомассы меняется.

Непрерывное культивирование в равновесном состоянии возможно только в том случае, когда все поступающие потоки, необходимые для накопления биомассы, точно сбалансированы с потоками, участвующими в выводе биомассы из системы. Это видно при рассмотрении общего материального баланса веществ в бактериальных клетках:

Клетки, добавляемые к системе — Клетки, удаляемые из системы -f--f- Клетки, образующиеся в процессе роста культуры — Клетки которые погибают = Клетки, накапливающиеся в системе

Математически это уравнение выражается следующим образомуа—~+^Х-аХ = ^, (10.7)

где F — скорость подачи среды в ферментер и ее выхода из него (л/ч), V — объем жидкости в ферментере (л), Хо и X— биомасса (г/л) соответственно в поступающем потоке среды и в самом ферментере, р— удельная скорость роста, ICE — удельная скорость гибели клеток (ч-1), dX/dt — скорость изменения биомассы (г/л*ч).

В состоянии равновесия dX/dt = 0. Теоретически объем чисто непрерывной культуры не меняется (на практике он подвержен незначительным колебаниям). Следовательно, скорости подачи среды в ферментер и выхода культуры из него должны быть одинаковыми. Наконец, поскольку удельная скорость гибели клеток почти всегда значительно меньше удельной скорости их роста, величину а можно не принимать во внимание. Исключения из этого правила наблюдаются только при очень низких скоростях роста микроорганизмов, в присутствии токсичных веществ или в случае культивирования в экстремальных биофизических условиях. При добавлении в ферментер стерильных питательных веществ Хо = 0, и если не принимать во внимание удельную скорость гибели клеток (аХ=0), то в равновесном состоянии

[K=z~r = D. (10.8)

Иными словами, удельная скорость роста популяции в ферментере определяется скоростью разбавления D, которая равна F/V.

Существует много типов непрерывного культивирования; некоторые из них подробно описаны в работах [2, 4]. В последующем обсуждении мы ограничимся двумя основными типами непрерывного культивирования: 1) «хемостатом», в котором состояние равновесия достигается путем регулирования поступления лимитирующих рост субстратов, и 2) «турбидостатом», в котором состояние равновесия достигается путем удаления биомассы и замещения ее свежей средой со скоростью, соответствующей росту культуры. В табл. 10.3 сравниваются различные стационарные параметры турбидостата и хемостата. Хемостат в отличие от турбидостата позволяет с высокой точностью регулировать условия лимитирования роста (субстратное лимитирование), тогда как турбидостат предпочтителен для изучения микроорганизмов в условиях роста, близких к максимальной удельной скорости.

Людекинг [38] опубликовал очень полезный обзор теории и практики непрерывного культивирования. В его статье приведены графический расчет и анализ систем непрер

страница 72
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)