Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

е отверстие колбы и ее горлышко.

8. Марлевую пробку приподнимают и держат ее так, 4тобы не допустить загрязнения стерильного содержимого колбы.

9. Горлышко колбы быстро вносят в пламя горелки и вращают его, чтобы выпарить конденсат на его внутренней стороне.

10. В колбу добавляют инокулят с соблюдением правил асептики и быстро закрывают ее пробкой.

11. Пробку закрепляют резинкой или металлической пружиной.

Описанная процедура предполагает использование таких пробок, которые не препятствуют быстрому газообмену и сохраняют стерильность. Если необходима очень быстрая инокуляция, можно не обжигать горлышко колбы; при соответствующем навыке удается сохранять стерильность и в этом случае.

Анаэробная культура

Для культивирования анаэробных бактерий можно использовать колбы Эрленмейера, а также любые другие колбы подходящих размеров. При этом необходимо соблюдать два основных условия: 1) питательная среда должна быть восстановлена до величины Eh =—150 мВ или ниже; 2) воздух из колб следует удалять. Специальные методики, используемые при работе с анаэробными бактериями, приведены в разд. 6.6.

При массовом культивировании анаэробов придерживаются следующих основных правил. Культуральные сосуды заполняют почти доверху, чтобы уменьшить влияние находящейся сверху газовой фазы. Вносят как можно больше инокулята на дно сосуда с восстановленной средой, стараясь держать пипетку вертикально. Воздух в сосуде заменяют очищенным от кислорода азотом или аргоном с 5—10% С02. Сначала среду инкубируют без перемешивания, но после того как начинается активный рост, ее перемешивают либо с помощью магнитной мешалки, либо пропусканием азота или другого природного газа через трубку, опущенную на дно сосуда. Используют гидрозатвор, который затрудняет выход газов в воздух. Предостережение: некоторые анаэробные бактерии образуют водород или метан, которые могут загораться или даже взрываться. Большинство анаэробов образуют СОг и другие газы, повышающие давление в сосудах до опасного уровня, если им не обеспечить своевременный выход.

10.1.3. Бутыли

Бутыли довольно часто используются для выращивания многолитровых культур бактерий в жидких средах, но существует несколько факторов, ограничивающих их применение. Так, при работе с большими стеклянными бутылями приготовление сред, их стерилизация и инокуляция сильно усложняются. Кроме того, встряхивание заполненных средой бутылей при аэробном культивировании микроорганизмов небезопасно. (Правда, при работе с пластмассовыми бутылями опасность значительно меньше.) В больших бутылях очень трудно перемешивать среду даже с помощью мешалок, поэтому создать в них достаточно высокую концентрацию кислорода — задача не из легких. Хотя при крупномасштабных работах часто приходится готовить среды в больших бутылях, культивирования бактерий в них следует по возможности избегать.

10.1.4. Ферментеры

Описанные ниже ферментеры и соответствующие методы культивирования в них в основном используются для выращивания аэробных бактерий, но они вполне пригодны (после небольших модификаций) и для выращивания анаэробов. Обсуждаемые здесь конструкции ферментеров предназначены для максимального снижения гетерогенности микробной популяции. Другие же ферментеры [например, колонные (plug-flow), с замкнутым контуром (closed-loop) и трубчатые], хотя и предоставляют интересные возможности для управления гетерогенностью популяции, не обсуждаются в данном руководстве. Основная литература, касающаяся конструкции ферментеров и характера работы с ними, приведена в табл. 10.1.

Таблица 10.1. Литературные источники данных по конструкции

ферментеров и работе с ними

Предмет

Источник данных

Проектирование ферментеров Общая конструкция

Способ действия: периодический

периодический с добавлением субстрата

(с подпиткой) непрерывный (проточный) диализный Управление работой ферментера: теория и логика управления

Физиологические эффекты: периодическая культура и периодическая культура с добавлением субстрата (с подпиткой) непрерывная (проточная) культура

диализ

иммобилизованные клетки

[2, 4, 9, 18, 22, 27, 29, 45]

[32, 36] [16, 32]

[18,43] [51]

[2, 3, 17, 33, 35, 43, 47, 51—53]

[2, 3, 5, 16, 24, 32, 38, 40]

[1,2, 23-25, 37, 41, 54] [14, 51] [6, 7, 13]

Ферментеры, или реакторы с мешалкой для культивирования бактерий, устроены таким образом, что обеспечивают постоянство среды. Рабочий объем ферментеров колеблется от 500 мл до тысяч литров. Обычные лабораторные ферментеры имеют рабочие объемы от 1 до 20 л. Поскольку они предназначены для того, чтобы максимально уменьшить температурный и химический концентрационный градиент в культуре, среда в них должна перемешиваться таким способом, чтобы достигалось быстрое и полное смешение всех компонентов жидкой фазы. В случае недостаточного перемешивания возникают застойные зоны, что приводит к появлению неконтролируемых локальных градиентов концентраций. Если перемешивание слабое, то популяция клеток будет сильно гетерогенной. Например, при слабом перемешивании аэробных культур контакт между кислородом воздуха и жидкой средой недостаточен, поэтому в некоторых участках ферментера могут создаваться почти анаэробные условия, что лимитирует рост культур. Если культивируют факультативно-аэробные микроорганизмы, то дыхательные характеристики разных клеток популяции могут сильно различаться, в результате чего снижается выход биомассы.

Ферментер можно сделать кустарным способом в мастерской, причем особое внимание следует уделить устройствам для перемешивания, аэрации и стерилизации, имеющимся в продаже. Необходимо также иметь гарантии асептики покупаемых блоков [12, 20, 31, 39]. Имеющиеся в продаже ферментеры (табл. 10.2) способны обеспечить хорошую аэрацию и перемешивание довольно густых культур. Ферментеры обычно оборудованы крышкой с рядом отверстий, через которые вводят датчики рН и растворенного кислорода, а также трубки для отбора проб и введения необходимых питательных веществ.

Аэрация и перемешивание

Минимальная скорость перемешивания, необходимая для достаточной подачи кислорода, подвержена изменениям, поскольку изменяются такие параметры, как плотность культуры (концентрация клеток) и условия культивирования (скорость и объем подачи воздуха, температура и объем жидкости в ферментере). В связи с тем что эта скорость зависит от факторов окружающей срг-ды, управлять процессом культивирования с ее помощью весьма неудобно. Предпочтительнее скорость перемешивания доводить до такой величины, при которой концентрация растворенного кислорода никогда не падала бы ниже 10—15% начальной насыщающей его концентрации. Поддержание концентрации растворенного в среде кислорода на уровне выше 10% насыщения при соответствующей температуре позволяет выращивать большинство бактериальных культур в таких условиях, когда кислород не является субстратом, лимитирующим их рост. Теория перемешивания в барботируемых системах основана на классической кинетике Моно для роста микроорганизмов, чувствительного к лимитирующим его субстратам [1].

Требования перемешивания для соответствующего снабжения культур кислородом почти всегда превышают

те, которые необходимы для хорошей гомогенизации высокорастворимых питательных компонентов. Это правило применимо также к условиям перемешивания в случае плохо растворимых субстратов, например углеводородов и стероидов. Для установления в культуральной среде требуемой концентрации кислорода можно изменять как скорость ее перемешивания, так и скорость подачи воздуха. Для управления культивированием аэробных микроорганизмов полезны приборы, контролирующие содержание растворенного кислорода и скорость подачи воздуха. Они позволяют оператору управлять концентрацией растворенного кислорода как независимым параметром культивирования [20].

Регулирование температуры

Большинство используемых в лабораториях ферментеров оборудовано встроенными теплообменниками. Температура циркулирующей воды (или другой охлаждающей жидкости) регулируется с помощью особого устройства, которое поддерживает постоянную температуру в ферментере. Ферментеры, имеющиеся в продаже, оснащены стандартными устройствами, регулирующими температуру, или имеют эти устройства в качестве вспомогательного оборудования. Иногда ферментер погружают в термостат с постоянной регулируемой температурой. Этот способ применяют в тех случаях, когда необходимо точное регулирование температуры.

Стерилизация воздуха

Воздух или другой газ, поступающий в ферментер, должен предварительно стерилизоваться. Наиболее простой способ стерилизации заключается в физическом удалении микроорганизмов фильтрацией воздуха через волокнистые фильтры. В большинстве лабораторных ферментеров используются заполненные стеклотканью трубчатые фильтры, но иногда применяют мембранные фильтры. В любом случае фильтры следует регулярно менять, чтобы обеспечить стерильные условия. Поскольку при длительном культивировании микроорганизмов существует опасность загрязнения фильтров, возникает

Необходимость в дополнительном (или предохраняющем) фильтре для стерилизации воздуха.

Фильтр для стерилизации воздуха можно изготовить из стальной трубки длиной 20 см и внутренним диаметром 2,5 см, оба конца которой подгоняют под соответствующие крышки или редукторы. В крышках трубки просверливают отверстия и укрепляют в них ниппели, с помощью которых она соединяется с резиновой трубкой. Тщательно очищенную стальную трубку неплотно набивают стеклянной ватой (90—150 кг/м3), после чего на каждом конце трубки укрепляют чистые крышки с соединительными ниппелями. Для предотвращения утечки газа перед укреплением крышек трубки обматывают специальной тефлоновой изоляционной лентой.

Фильтр для стерилизации воздуха перед первым использованием следует простерилизовать в течение 2 ч при 170—190 °С, завернув его в алюминиевую фольгу. После стерилизации и охлаждения фильтра проверяют, надежно ли укреплены крышки, и затем подсоединяют фильтр к трубке, через которую подается воздух. Выходное отверстие фильтра соединяют с ферментером

страница 71
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.08.2017)