Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

рантная) кривая роста отражает скорее изменение морфологических характеристик клеток, чем изменение их количества.

Кривые роста, представленные в виде зависимости логарифма числа клеток от времени, иногда показывают необычно быстрое увеличение числа клеток сразу после лаг-фазы, вслед за чем скорость накопления клеток понижается. Это необычное значительное ускорение роста указывает на частичную или полную синхронизацию деления клеток в культуре. Не исключено, что такой синхронизованный рост обусловлен приспособлением культуры к новому питательному компоненту или прорастанием спор. Затем синхронность культуры быстро нарушается, и через две генерации преобладает асинхронный рост. Однако разработаны специальные методы, с помощью которых можно синхронизировать деление клеток в растущей популяции, так что рост популяции соответствует росту отдельных клеток (разд. 10.3.3).

Большинство микроорганизмов размножаются путем бинарного деления отдельных клеток, но у некоторых, например у актиномицетов, размножение связано с ростом гиф. Если первичный рост культуры происходит за счет вытягивания концов гиф, то зависимость увеличения клеточной массы от времени будет линейной.

Линейный рост наблюдается и в том случае, когда добавление к среде критического питательного компонента регулируется линейным процессом (например, с помощью дробных добавок или диффузии) и этот процесс становится лимитирующим. Например, ограниченная диффузия воздуха в пробирку через ватную пробку или питательных компонентов через мембрану в диализную культуру [51] может перевести экспоненциальный рост в линейный.

В жидкой культуре нитчатые микроорганизмы часто образуют шарообразные скопления. В этом случае увеличение биомассы происходит медленнее, чем при экспоненциальном росте и пропорционально времени в третьей степени. Рост микроорганизмов в шарообразных скоплениях может зависеть от диффузии питательных компонентов внутрь этих скоплений и выхода наружу продуктов метаболизма, что не предусматривается в уравнении (10.5).

В комплексной среде бактериальные клетки часто используют имеющиеся субстраты последовательно. Присутствие определенных субстратов может привести к подавлению синтеза ферментов, участвующих в метаболизме других питательных веществ. В этом случае ферменты, катализирующие метаболизм некоторых веществ, начинают действовать лишь после того, как концентрация субстратов, репрессирующих их синтез, уменьшится в результате использования клетками. Регуляция физиологии бактерий приводит к изменениям кривой роста и появлению одной или нескольких переходных (т. е. временных) стационарных фаз. Такой ответ культуры на изменение состава среды называют диауксией. Классическим примером диауксии может служить рост Escherichia coli в присутствии глюкозы и лактозы (рис. 10.2). Сначала происходит рост культуры за счет использова

ния глюкозы. После исчерпания этого субстрата кривая роста резко меняет свой наклон, так что биомасса может даже уменьшиться. Во время этой лаг-фазы индуцируется синтез новой ферментной системы, участвующей в метаболизме лактозы, и накопление биомассы продолжается за счет потребления этого сахара.

10.1.1. Культуральные пробирки

Лишенные бортиков пробирки из стекла пирекс (обычно размером 16X150 мм) очень удобны для выращивания периодической жидкой культуры бактерий и широко используются для этой цели. Однако при культивировании аэробов в пробирках обычно удовлетворяется лишь минимальная их потребность в кислороде. Многие бактерии являются факультативными анаэробами, поэтому в преобладающем большинстве случаев при культивировании в пробирках они растут хорошо.

Для того чтобы улучшить аэрацию жидкой культуры в пробирке, увеличивают отношение поверхности среды к объему, например уменьшая объем среды или наклоняя пробирку. Еще лучше поместить пробирки на качалку, благодаря чему получают активное перемешивание среды. Снабжение воздухом улучшается, если для закрывания пробирок используют неплотные ватные пробки, колпачки типа Morton (Scientific Products) или проницаемые для газов мембранные пробки. Хотя мембранные пробки используют довольно редко, они очень эффективны, поскольку хорошо проницаемы для обменивающихся газов и в то же время почти непроницаемы для водных паров, т. е. среда при этом не испаряется. Мембранные пробки производятся в виде колпачков типа Morton с тонкой поликарбонатной мембраной, встроенной в верхнюю часть колпачка (Kimble Р. М. Сар Closure Scientific Products).

Более подробно условия оптимизации аэрирования в лабораторных культуральных сосудах описываются в разд. 10.1.2. Условия обеспечения строгого анаэробиоза для культур в пробирках приведены в разд. 6.6.

10.1.2. Качалочные колбы

В качестве сосудов для получения биомассы в лабораторных условиях или на первом этапе в промышленных процессах, включающих периодическое культивирование бактерий в жидкой среде, широко используются колбы Эрленмейера объемом от 100 до 2000 мл. При этом для облигатных или факультативных аэробов подбираются максимально эффективные условия подачи воздуха (кислорода), а для анаэробов — такие же условия удаления воздуха.

Аэробная культура

Аэробное культивирование в колбах должно происходить при постоянном их встряхивании для того, чтобы облегчить массопередачу кислорода (а также других газов и питательных компонентов) на двух уровнях: из газовой фазы через поверхность раздела газ — жидкость в жидкую фазу, а также из жидкой фазы через поверхность раздела жидкость — клеточная поверхность внутрь клеток. На способность системы культивирования в колбах удовлетворить потребность бактерий в кислороде влияют два основных фактора: газообмен через пробку колбы и площадь поверхности жидкости, доступная для транспорта кислорода из газовой фазы.

Пробки (крышки) в культуральных колбах должны обеспечивать адекватный обмен газами между наружной средой и содержимым колбы в стерильных условиях. Негигроскопические ватные пробки, обернутые марлей, пригодны для культивирования аэробных бактерий до невысокого уровня плотности. Однако, если эти пробки

Слишком велики для колб или если они очень плотные, они затрудняют доступ кислорода в бактериальные культуры высокой плотности [58]. В таком случае следует использовать ватно-марлевые пробки (рис. 10.10), обеспечивающие лучший доступ кислорода. Их делают следующим образом.

1. Один слой негигроскопической ваты кладут между двумя слоями хирургической марли.

2. Разрезают эту ватно-марлевую подушку на квадраты такого размера, чтобы ею можно было обернуть горлышко колбы.

3. Помещают квадратную подушку на горлышко колбы и фиксируют ее с помощью металлической пружины или двух (для большей надежности) резинок. Металлическую пружину можно изготовить из толстой рояльной струны, изогнув ее соответствующим образом.

Колпачки типа Morton также обеспечивают достаточно стерильное закрывание колб и хороший газообмен, однако при высоких скоростях вращения они могут отвинчиваться. Для закрывания колб при культивировании на качалке пригодны также пробки из пенопласта. Их надо подбирать так, чтобы они плотно входили в горлышко колбы без дополнительных усилий. Но следует помнить о том, что пробки могут содержать пластификаторы или другие токсичные вещества; поэтому перед использованием их следует тщательно промывать. Колпачки и пробки производятся различными фирмами (например, Arthur Н. Thomas, Scientific Products, Bellco Glass, Inc.).

Поглощение растворенного кислорода жидкой бактериальной культурой зависит от плотности клеток и скорости их роста. Потребность в растворенном кислороде определяется его использованием клетками и удовлетворяется за счет постоянной диффузии кислорода из газовой фазы в жидкую. Область поверхностного контакта между газом и жидкостью часто регулирует поглощение кислорода или объемную скорость его переноса. Если эта область велика, то скорость переноса больших объемов кислорода также значительна, что позволяет культуре с высокой плотностью быстро расти без лимитирования по 02. Область поверхностного контакта увеличивается при снижении отношения объема жидкости к объему колбы или при встряхивании колбы. Дефицит кислорода, вызванный его ограниченной диффузией, можно свести к минимуму, если заполнять жидкой средой не более 20% объема колбы и встряхивать колбы со скоростью 200—350 об/мин на круговой качалке с величиной хода 2,5 см или со скоростью 150—250 качаний в 1 мин на качалке с поступательным ходом.

Во время инкубации культур в колбах при соответствующей температуре в процессе кругового встряхивания жидкость должна подниматься примерно на 2/3 высоты колбы. Это условие обычно достигается при заполнении 250-миллилитровой колбы Эрленмейера с отбойниками 50 мл среды и вращением ее на качалке со скоростью около 220 об/мин и величиной хода 2,5 см. Встряхивание на качалке с возвратно-поступательным движением должно быть настолько эффективным, чтобы вызывать значительную турбулизацию жидкости при ее движении от одного края колбы к другому [23].

В используемых при этом колбах с отбойниками происходит разбивание образующихся потоков жидкости при вращении колб на круговой качалке. Такие колбы производятся фирмой Bellco Glass Со. и другими.

Ниже приведена методика культивирования аэробных бактерий на качалке в колбах с марлевыми пробками.

1. В 250-миллилитровую колбу Эрленмейера вносят 50 мл соответствующей среды.

2. Делают, как описано выше, марлевую пробку.

3. Пробку кладут на горлышко колбы, надежно закрепляют ее резинкой или пружиной и покрывают сверху алюминиевой фольгой.

4. Фольгу обжимают вокруг пробки и горлышка колбы, чтобы предотвратить конденсацию жидкости во время автоклавирования.

5. Повторяют эту процедуру со всеми колбами и затем стерилизуют их автоклавированием, как описано в гл. 23 (т. 3).

6. Непосредственно перед инокуляцией удаляют алюминиевую фольгу.

7. Осторожно снимают резинки или поддерживающие пружины, стараясь не сдвинуть пробку. Пробка подходящего размера приобретает после автоклавирования форму колпачка (крышки), прикрывающего входно

страница 70
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.08.2017)