аличии соединений азота (например, сульфата аммония), но в безазотистых средах ведут себя как микроаэрофилы. Например, Azospiriltum в условиях фиксации N2 лучше всего растет в атмосфере, содержащей 1 % кислорода. Это происходит из-за инактивации избытком кислорода нитрогеназного комплекса, катализирующего процесс азотфиксации.

При условии низкого содержания кислорода микроаэрофилы можно выращивать и в жидких, и на твердых средах, но в этом условии нет необходимости при использовании полужидкой среды с 0,1—0,4% агара. Геле-образующие вещества расслаивают среду таким образом, что конвекционные потоки не способны смешивать богатые кислородом верхние слои среды с нижними. Единственным путем для проникновения кислорода в более глубокие слои пробирки с полужидкой средой является диффузия. Таким образом, в пробирках с полужидкой средой создается градиент кислорода, где поверхность среды является местом наиболее высокого содержания кислорода. При инокуляции среды путем укола петлей микроаэрофилы начинают расти несколько ниже поверхности, где концентрация кислорода для них наиболее благоприятна. Рост начинается в форме тонких дисков, которые заметны на расстоянии нескольких миллиметров или сантиметров от поверхности. По мере роста диски становятся более плотными и перемещаются ближе к поверхности. В конце концов клетки образуют очень плотный диффузный слой непосредственно под поверхностью среды. Анаэробы, напротив, начинают расти в нижней части полужидкой среды, но впоследствии могут также расти по всей среде, если создаются анаэробные условия.

Микроаэрофил Campylobacter fetus легко культивировать в пробирках с полужидкой средой для бруцелл (бульон для бруцелл, содержащий 0,15—0,3% агара; разд. 8.5.14). Азотфиксирующие клетки Azospirillum хорошо растут в полужидкой среде с малатом, дефицитной по азоту (разд. 8.5.37 или 20.3.4). В литровых бутылях PY, содержащих слой полужидкой среды, можно получать большие биомассы этой бактерии для физиологических исследований [13].

Если пробирки с полужидкой средой хранятся долгое время, кислород может диффундировать в глубь среды. Градиент кислорода удается восстановить после того, как такие пробирки помещают на несколько минут в кипящую водяную баню, а затем дают возможность пробиркам остыть, а среде затвердеть.

9.3.2. Определение подвижности бактерий

Полужидкие среды можно также использовать для определения подвижности бактерий. Для этого пробирку со средой для определения подвижности (бульон, содержащий 0,4% агара) инокулируют уколом прямой иглой до середины агарового слоя. В процессе роста подвижные бактерии мигрируют от линии инокуляции, образуя диффузную мутную зону в окружающей среде, тогда как неподвижные бактерии растут только по уколу (линии инокуляции).

Этот метод можно модифицировать следующим образом. В полужидкую среду помещают открытую с обоих концов и предварительно простерилизоваиную стеклянную трубочку (рис. 9.3), в которую вносят инокулят. Подвижные микроорганизмы мигрируют вниз, выходят из нижнего конца трубочки и затем начинают двигаться вверх к поверхности среды, где усиленно растут. Этот метод пригоден также для селекции высокоподвижных организмов, используемых для приготовления Н-антиге-нов при иммунизации.

9.3.3. Хемотаксис

Полужидкую среду используют, кроме того, при изучении хемотаксиса. Например, Адлер [1] использовал

полужидкую среду, содержащую окисляемое соединение углерода как источник энергии, для исследования положительного хемотаксиса Escherichia coli. При внесении большого инокулята в центр чашек Петри со средой клетки Е. coli мигрируют к периферии в форме расходящегося круга и по мере продвижения используют весь окисляемый субстрат. При добавлении к среде двух окисляемых соединений углерода образуются два кольца из клеток, мигрирующих с различными скоростями. В отличие от методов изучения хемотаксиса в капиллярных трубках в данном случае запас кислорода в чашках с агаризо-ванной средой никогда не истощается; поэтому мигрирующие кольца клеток появляются только в ответ на сформированный этими клетками градиент субстрата, а не на самопроизвольный градиент кислорода.

С помощью полужидкой среды можно изучать также отрицательный хемотаксис [18]. В этом случае клетки Е. coli суспендируют в среде в концентрации, достаточной для того, чтобы появилось заметное помутнение. Затем инокулированную среду разливают в чашки Петри. После того как среда приобретает гелеобразную консистенцию, в нее вносят кусочек твердого 2%-пого агара, содержащего предполагаемое репеллентное вещество. Если вещество действительно является репеллентом, то окружающие его бактерии мигрируют в стороны от кусочка агара и оставляют за собой прозрачный след, который становится видимым примерно через 30 мин.

Использование полужидкой среды позволяет также осуществлять селекцию мутантов, не способных к хемотаксису [2, 18]. В случае положительного хемотаксиса эти мутанты (а также неподвижные мутанты) не реагируют на сформированный клетками градиент субстрата и остаются в центре чашки Петри, откуда их можно извлечь для субкультивирования и очистки. В случае отрицательного хемотаксиса мутанты, не способные к хемотаксису, можно выделить из прозрачной зоны, окружающей кусочек твердого агара.

9.4. ЛИТЕРАТУРА

1. Adler J. Chemotaxis in bacteria, Science, 153, 708—716 (1966).

2. Armstrong L В., Adler J., Dahl M. M. Non-chemotactic mutants of Escherichia coli, J. Bacteriol., 93, 390—398 (1967).

3. Bowdre J. H., Krieg N. R. Water quality monitoring: bacteria as indicators. Va. Polytech. Inst. State Univ. Water Resour. Cent. Bull., 69, 1974.

4. Bridson E. Y., Brecker A. Design and formulation of culture media, p. 229—295. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. ЗА, Academic Press, Inc., New York, 1970.

5. Castaneda M. R. A practical method for routine blood cultures in brucellosis, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 64, 114—115 (1947).

6. Codner R. C. Solid and solidified growth media in microbiology, p. 427—454. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 1, Academic Press, Inc., New York, 1969.

7. Funk H. В., Krulwich T. A. Preparation of clear silica gels that can be streaked, J. Bacteriol., 88, 1200—1201 (1964).

8. Gerhardt P., Heden C. G. Concentrated culture of gonococci in clear liquid medium, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 105, 49—51 (1960).

9. Hall M. M., Mueske C. A., Ilstrup D. M., Washington J. A., II. Evaluation of a biphasic medium for blood cultures, J. Clin. Microbiol., 10, 673—676 (1979).

10. Hoffman P. H., George H. A., Krieg N. R., Smibert R. M. Studies of the microaerophilic nature of Campylobacter fetus subspecies jejuni, II. Role of exogenous superoxide anions and hydrogen peroxide, Can. J. Microbiol., 25, 8—16 (1979).

11. Lines A. D. Value of the ?+ salt of carrageenan as an agar substitute in routine bacteriological media, Appl. Environ, Microbiol., 34, 637—639 (1977).

12. Meynell G. G., Meynell E. Theory and practice in experimental bacteriology, Cambridge University Press, London, 1965. [Имеется перевод: Мейнел Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология (Теория и практика). — М.: Мир, 1967.]

13. Okon Y., Albrecht S. L., Burr is R. H. Carbon and ammonia metabolism of Spirillum lipoferum, J. Bacteriol., 128, 592—597 (1976).

14. Schultz J. S., Gerhardt P. Dialysis culture of microorganisms: design, theory and results. Bacteriol. Rev., 33, 1—47 (1969).

15. Sirotnak F. M., Donati G. J., Hutchison D. ]. Folic acid derivatives synthesized during growth of Diplococcus pneumoniae, J. Bacteriol, 85, 658—665 (1963).

16. Sneath P. H. A. Failure of Chromobacterium violaceum to grow on nutrient agar, attributed to hydrogen peroxide, J. Gen. Microbiol, 13, 1 (1955).

17. Towle G. A., Whistler R. L. Hemicellulose and gums, p. 198—248. In: L. P. Miller (ed.), Phytochemistry, vol. 1, Van Nostrand Reinhold Co, New York, 1973.

18. Tso W., Adler J. Negative chemotaxis in Escherichia coli, J. Bacteriol., 118, 560—576 (1974).

19. Tyrrell E. A., MacDonald R. E., Gerhardt P. Biphasic system for growing bactteria in concentrated culture, J. Bacteriol, 75, 1—4 (1958).

20. Waterworth P. M. The action of light on culture media, J. Clin. Pathol, 22, 273—277 (1969).

21. Watson N., Apiron D. Substitute for agar in solid media for common usages in microbiology, Appl. Environ. Microbiol, 31, 509— 513 (1976).

22. Weinstein M. /, Wagman G. H. (eds.). Antibiotics: isolation, separation and purification, Elsevier Scientific Publishing Co, New York, 1978.

Глава 10

ЖИДКАЯ КУЛЬТУРА С. Дрю

Культивирование бактерий представляет собой процесс увеличения концентрации некоторых или всех компонентов популяции. Обычно характеристики этого процесса устанавливаются путем измерений тех или иных его показателей. Чаще всего измеряют увеличение числа клеток или клеточной массы (биомассы). Реже рост оценивают по синтезу макромолекул, когда увеличение количества белка, рибонуклеиновых кислот, липидов или других макромолекул отражает увеличение биомассы и числа клеток (сбалансированный рост). Однако один или несколько из этих показателей могут не зависеть от других (несбалансированный рост). Например, на ранней и поздней стадиях роста периодической культуры увеличение биомассы непропорционально числу клеток. В гл. 11 обсуждаются основные аспекты роста бактерий, методы его измерения и допущения, необходимые при использовании каждого метода.

В этой главе рассматриваются методы культивирования бактерий в жидких средах объемом от 10 мл до 100 л. Они пригодны для выращивания чистых культур бактерий в водной среде с различной степенью контроля за физическими условиями. После небольшой модификации методы можно использовать для смешанного культивирования двух или большего числа видов бактерий. Однако в задачи данной книги не входит обсуждение этого интересного раздела роста бактериальных культур.

Измерения роста микроорганизмов осложняются тем, что бактериальные культуры в значительной степени ге-терогенны.