Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

еет определенные недостатки.

1. Твердая культура имеет ограничения при выращивании больших количеств биомассы. Она дает возможность легко получать граммы клеток; десятки граммов выращивать уже затруднительно, а сотни граммов или килограммы клеток на твердой среде в лаборатории вырастить невозможно.

2. Твердые культуры не обеспечивают однородность популяции клеток в физиологическом отношении. Например, клетки в верхней части твердой аэробной среды (слой глубиной до 1000 клеток) могут находиться в условиях низкого содержания питательных веществ, но высокого содержания кислорода, в то время как в нижних слоях среды условия могут быть противоположными.

3. Твердые культуры характеризуются небольшим числом клеток в пересчете на данное количество среды.

9.2.2. Двухфазная массовая культура

Преимущества культуры, выращиваемой на твердой среде, сохраняются, а недостатки устраняются при использовании методов выращивания так называемой жидкой/твердой культуры, или двухфазной. Она по существу представляет собой форму диализной или диффузионной культуры, где вместо обычной мембраны имеется поверхность раздела фаз, которая как диффузионный барьер отделяет культуру от резервуара с питательной средой и продуктами обмена. Основные положения и история развития двухфазной диализной культуры как частного случая мембранной диализной культуры даны в обзоре Шульца и Герхардта [14], а методы культивирования с диализом описаны в следующей главе (разд. 10.3.4). Двухфазная система для концентрированной бактериальной культуры систематически изучалась Тиррелом и др. [19].

Двухфазная система в принципе состоит из толстого слоя затвердевшей питательной среды, покрытого тонким слоем питательного бульона (рис. 9.1). Чтобы приготовить такую систему, частично заполняют сосуд горячей средой, содержащей 2—3% агара. После затвердения агарового слоя на него наливают с соблюдением правил асептики небольшое количество питательной среды, засевают ее и инкубируют. Для выращивания аэробов культуральный сосуд помещают на качалку, что обеспечивает хорошее снабжение кислородом и перемешивание среды во время инкубации. Культура развивается в жидкой части среды, но постепенно клетки диффундируют в твердую питательную среду и значительно концентрируются. Таким способом можно получить популяции с плотностью более 1011 клеток/мл, причем данный метод пригоден для выращивания бактерий любого типа.

Подходящим сосудом для такого способа культивирования бактерий является колба Эрленмейера; имеющиеся у ее основания выступы удерживают агар при встряхивании колбы на качалке. Для этих же целей пригодны прямоугольные сосуды. Если во время инкубации на качалке агар раскалывается, то следует использовать среду с более высоким содержанием отверРис. 9.2. Двухфазная система для культуры из крови на твердых и жидких средах 1 — пробка, через которую вводится проба крови; 2 — воздух с 10%-ным содержанием углекислого газа; 3— твердая агаровая среда; 4 — жидкая среда.

дителя. Поскольку перемещение питательных веществ зависит от диффузии, глубина агарового слоя должна быть не более 5 см. Отношение твердой фазы к жидкой должно быть не менее 4:1 и не более 10: 1 в зависимости от того, что наиболее важно — выход биомассы или концентрация клеток.

Если все компоненты среды присутствуют в агаровом слое, то на него можно нанести слой дистиллированной воды и после уравновешивания в течение ночи инокули-ровать бактериями. В таком верхнем слое можно вырастить относительно чистую и плотную популяцию не^ которых бактерий, например гонококков, которые обычно культивируют в мутной среде, обогащенной кровью и крахмалом, и для которых характерно образование неплотных популяций [8].

Другим примером двухфазной культуральной системы является система, созданная Кастанедой [5] для выделения Brucella из крови (рис. 9.2). Правда, принцип диализа используется в этой системе весьма ограниченно. Для приготовления системы сначала стерилизуют 3%-ную агаровую среду в прямоугольной бутыли с ватной пробкой, а затем бутыль кладут на бок, чтобы расплавленная среда образовала твердый слой на ее боковой стенке. После этого бутыль ставят в вертикальное положение, добавляют с соблюдением правил асептики стерильную жидкую среду и закрывают бутыль резиновой пробкой с мембраной. Для некоторых бактерий, таких, как Brucella abortus, иногда необходимо заменить обычный воздух в бутыли на воздух, содержащий 10% двуокиси углерода. Пробу крови вводят шприцем через резиновую пробку и инкубируют бутыль в вертикальном положении. Через каждые 2 дня наклоняют бутыль так, чтобы жидкая среда смочила всю поверхность агара, а затем вновь ставят ее вертикально, чтобы среда стекала к дну бутыли. При этом бактерии, находящиеся в жидкой среде, инокулируют поверхность агара и образуют видимые колонии. Описанный метод имеет ряд преимуществ перед выращиванием бактерий в жидкой среде. Во-первых, нет необходимости многократно открывать бутыль, чтобы получать пробы для микроскопирования или для субкультивирования при определении интенсивности роста. Это уменьшает возможность лабораторного заражения такими высоковирулентными бактериями, как Brucella, а также снижает возможность загрязнения самой культуры. Во-вторых, организмы, плохо растущие в жидкой среде, могут лучше расти на поверхности агара. И в-третьих, рост бактерий в присутствии окрашивающих и придающих мутность веществ, который трудно наблюдать в жидкой среде, легко обнаружить по развитию колоний на поверхности агара. Последние исследования Холла и др. [9] показали пригодность такой культуральной системы для обнаружения роста многих патогенных бактерий.

9.2.3. Биоавтография

Биоавтография является вариантом бумажной хроматографии, когда рост бактерий используется как высокочувствительный индикатор для выявления положения определенных веществ на хроматограмме. Метод имеет преимущества специфического определения веществ с биологической активностью, чего лишены химическая и радиоизотопная системы их обнаружения. Он применим при определении положения на хроматограммах факторов роста из супернатантов культур или клеточных экстрактов, когда концентрация этих факторов настолько низка, что их нельзя обнаружить другими обычными методами. Например, с помощью биоавтографии можно определить на хроматограмме 5—10 нг фолиевой кислоты. Примеры использования биоавтографии для определения факторов роста в клеточных экстрактах приведены в работе [15]. Биоавтографию широко используют также в фармацевтической промышленности для обнаружения антибиотиков на бумажных хроматограммах [22].

Для определения факторов роста готовят агаровую среду, содержащую все питательные компоненты, необходимые для обеспечения роста определенного штамма, кроме того фактора, который хотят определить. Стерильную расплавленную среду инокулируют при 45— 50 °С отмытой суспензией определенного штамма бактерий. Наливают эту питательную агаровую среду в стерильную чашку, достаточно большую для помещения в нее бумажной хроматограммы (чашку можно прикрыть крышкой из пирекса). После затвердения среды на поверхность агара помещают высушенную бумажную хроматограмму лицевой стороной вниз. При этом обращают внимание на то, чтобы между агаром и бумагой не оставалось воздушного пространства. После инкубации хроматограмму вынимают и находят на агаре зоны наиболее сильного роста бактерий, которые соответствуют местоположениям фактора роста. Внесение слоя воды на поверхность агара часто помогает сделать эти области лучше видимыми.

Для успешного проведения биоавтографии выращивание бактерий, используемых в качестве инокулята, обычно проводят в жидкой среде, содержащей минимальную концентрацию определяемого фактора роста. Таким путем удается избежать избыточного накопления его в клетках бактерий, которое может приводить к неспецифическому росту бактерий на питательной агаровой среде. Для достижения максимальной чувствительности рассматриваемого метода определения факторов роста следует использовать высокую концентрацию клеток, высеваемых на агар, чтобы в местах расположения исследуемого фактора на хроматограмме появились хорошо видимые области скопления выросших бактерий. Наиболее подходящую концентрацию инокулята определяют в предварительных экспериментах. Контаминирую-щие бактерии, которые могут присутствовать на бумажной хроматограмме, обычно не мешают определению, поскольку они растут в виде отдельных колоний и их трудно спутать с более плотным диффузным ростом в агаре индикаторных микроорганизмов. Тем не менее количество контаминирующих бактерий следует свести к минимуму. Поэтому высушенные хроматограммы хранят в стерильных конвертах вплоть до использования, а накладывают хроматограммы на питательный агар в помещении, где нет воздушных потоков, переносящих пыль.

При биоавтографии антибиотиков агаровая среда должна содержать полный набор питательных субстратов. Это дает возможность микроорганизму расти по всей поверхности среды кроме тех зон, где на хроматограмме находятся антибиотики. Из-за высокой активности некоторых антибиотиков иногда полезно помещать бумажную хроматограмму на поверхность агара только на короткое время (около 10 мин), а затем снимать ее перед инкубацией чашки. Если надолго оставить хроматограмму на поверхности агара, то зоны ингибирования роста бактерий могут быть слишком большими, и тогда их трудно отчетливо различать.

9.3. МЕТОДЫ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИИ НА ПОЛУЖИДКИХ СРЕДАХ

Полужидкая среда содержит гелеобразующее вещество в низкой концентрации и имеет мягкую желеподоб-ную консистенцию. Такая среда пригодна для культивирования микроаэрофильных бактерий, а также для изучения подвижности клеток и хемотаксиса.

9.3.1. Микроаэрофилы

Микроаэрофильным бактериям присуще аэробное дыхание, т. е. в качестве конечного акцептора электронов они используют кислород. Но они не растут в атмосфере с таким содержанием кислорода, как в воздухе (21%). Например, Campylobacter fetus лучше всего растет в атмосфере, содержащей 6% кислорода. Некоторые азотфиксирующие бактерии могут расти в аэробных условиях при н

страница 67
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.06.2017)