Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

терилизации среды и охлаждения ее до 45—50 °С к ней добавляют с соблюдением правил асептики достаточное для получения необходимого значения рН количество стерильной кислоты. Для того чтобы экспериментально определить точное количество кислоты, которое необходимо добавить к основному раствору, полезно приготовить дополнительную порцию среды.

Если требуются пробирки со скошенной средой, то сразу же после автоклавирования их ставят в наклонное положение и дают среде остыть и затвердеть. При приготовлении среды в чашках Петри вначале расплавленную среду охлаждают до 45—50 °С в водяной бане в течение 10 мин, а затем с соблюдением правил асептики разливают в стерильные чашки (обычно 15—20 мл на чашку). Чашки с агаром накрывают сразу не стеклянными крышками (на них конденсируется влага), а бумагой или другим изолирующим материалом. После затвердения агара на его поверхности могут образоваться капли влаги. Перед инокуляцией дают возможность этой влаге испариться. Хранение чашек в перевернутом положении при комнатной температуре обычно обеспечивает достаточное высыхание агара. Чтобы ускорить испарение влаги, перевернутые чашки помещают на полку воздушного термостата при температуре 45 °С, где устанавливают их в наклонном положении. Инкубируют чашки в таком положении до тех пор, пока не исчезнут капли воды. Для некоторых методов посева, таких, как методы с использованием бархатных репликаторов, необходимы чашки с агаром, высушенным более основательно.

Для предохранения чашек с агаром от чрезмерного высыхания их помещают в закрытые полиэтиленовые мешки (для этой цели пригодны мешки, в которые обычно запаковывают пластмассовые чашки Петри). Чашки со средой хранят в таких условиях при комнатной температуре в течение 4—5 нед.

Все жидкие и твердые среды следует хранить в темной комнате или шкафу. Хранение чашек со средами на свету, особенно солнечном, например возле окна, может привести к фотохимическому образованию перекиси водорода или других токсичных форм соединений кислорода, что способствует иногда ингибированию роста бактерий [16, 20]. Особенно чувствительными в этом отношении оказались микроаэрофилы (3, 10].

9.1.2. Каррагенан

Каррагенан, давно используемый в пищевой и молочной промышленности, только в последнее время стал употребляться как отвердитель для биологических сред. Он известен также под названием «ирландский мох» или «растительная желатина»; его добывают путем экстракции из определенных видов красных морских водорослей. Существует несколько типов каррагена-на: каппа, лямбда, мю и йота [17]. Калиевые соли кар-рагенана типа каппа способны образовывать плотные прозрачные гели, которые могут быть эффективными заменителями агара во многих бактериологических средах [11,21].

Каррагенан значительно дешевле агара. Подобно агаровым гелям, гели каррагенана можно использовать при посеве штрихом или разливом жидкой культуры. Каррагенан не разрушается большинством видов бактерий. Из него можно готовить гели, устойчивые к темЧАСТЬ П. РОСТ

пературам до 60 °С. Однако каррагенан имеет некоторые недостатки. Высокая температура, при которой следует разливать жидкую среду с каррагенаном по чашкам Петри (от 55 до 60 °С), может препятствовать его использованию для выращивания бактерий, когда разведения суспензии клеток вносят в расплавленную среду перед ее затвердением.

Разные каррагенаны заметно отличаются друг от друга [21]. Некоторые исследователи обнаружили, что каррагенан не пригоден для полужидких сред, в то время как другие считают, что его можно использовать для этой цели ЦП]. В отличие от агара каррагенан может вызывать изменения рН некоторых сред в процессе их приготовления и стерилизации. Поэтому для каждой среды следует определять, меняется ли и в какой степени значение ее рН при добавлении каррагенана. Для предупреждения таких изменений следует готовить среды с разными исходными значениями рН или увеличивать их буферную емкость. Особенно сильно снижается рН при добавлении каррагенана к средам, содержащим фосфатный буфер [11].

Среды с каррагенаном готовят так же, как и среды с агаром. Каррагенан, классифицируемый при продаже как тип I (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) и содержащий в основном мох типа каппа и в меньшей степени типа лямбда, оказался пригодным почти для всех целей. Для гелей, устойчивых при 45 °С, добавляют 2% каррагенана; а для гелей, устойчивых при 60 °С — 2,4% [11]. После добавления каррагенана к основной жидкой среде ее кипятят, чтобы полностью растворить его, а затем стерилизуют автоклавироваиием. Стерильную среду охлаждают до 55—60 °С, разливают в чашки Петри и дают застыть. Поскольку среду с каррагенаном разливать с помощью пипетки довольно трудно, ее следует разливать непосредственно из бутылей и колб. Конденсирующуюся на геле воду удаляют таким же путем, как в случае применения агара.

9.1.3. Силикагель

Отвердение сред с помощью минерального вещества силикагеля применяют для получения культур автотрофных бактерий, так как при этом в среде отсутствуют органические вещества. Кроме того, при добавлении в такие минеральные среды различных органических веществ можно исследовать способность гетеротрофных бактерий использовать их в качестве единственных источников углерода. С помощью силикагелевых сред можно также определять потребность бактерий в витаминах.

Для приготовления силикагелевых сред существует много различных методов [4]. Метод Функа и Кралвича [7] прост, надежен и обеспечивает получение прозрачных и достаточно прочных гелей, на которые без затруднений можно высевать бактерии штрихом инокуляционной иглой или размыванием инокулята с помощью стеклянного шпателя. При их использовании готовят следующие растворы.

Жидкая питательная среда двойной концентрации. Ее готовят, как обычно, и стерилизуют автоклавированием.

Раствор силиката калия. К 100 мл 7%-ного (вес/ /объем) КОН добавляют 10 г порошкообразного силика-геля (N 923, 100—200 меш, Fisher Scientific Co., Pittsburg, Pa.) или кремневой кислоты (reagent grade, J. Т. Baker Chemical Co., Phillipsburg, N.J.) и смесь нагревают до растворения ингредиентов. Разливают в колбы порции по 20 мл и стерилизуют их в автоклаве.

Раствор фосфорной кислоты. Готовят 20%-ный раствор о-фосфорной кислоты из 85%-ной кислоты (certified grade; Fisher Scientific Co.).

20 мл стерильной среды двойной концентрации добавляют к 20 мл стерильного раствора силиката калия. В этот раствор быстро вносят известное количество фосфорной кислоты, достаточное для доведения рН до 7,0 (согласно предварительным экспериментам, около 4 мл). Растворы перемешивают и немедленно разливают в две чашки Петри. Среда начинает затвердевать через 1 мин и становится твердой через 15 мин. Чтобы испарилась конденсированная вода, чашки ставят на некоторое время в термостат. После инокуляции среды для предупреждения высыхания и растрескивания геля чашки инкубируют во влажной атмосфере.

9.2. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ТВЕРДЫХ СРЕДАХ

9.2.1. Массовая культура на твердой поверхности

Выращиванием колоний на твердой поверхности получают максимальную плотность бактериальных клеток, поскольку в данном случае жидкость находится только в промежуточном (межклеточном) пространстве и составляет от 20 до 30% общего объема (27% от плотно упакованных сфер, независимо от их размера). Если инокулят сильно разбавлен, каждая клетка в результате деления дает начало отдельной колонии. Это может быть полезным для массовой культуры, если отбор колонии ведут по какому-то одному признаку (например, если необходимо вырастить вариант, который образует только «гладкие» колонии). Чаще инокулят бывает не разбавлен, и его равномерно разливают по всей поверхности среды: в этом случае бактерии растут в виде сплошного газона. Твердую поверхность обычно получают после добавления в среду агара или другого отвердителя. Известно также несколько методов, при которых колонии растут на мембране, помещенной на поверхности жидкой среды в сосуде [14].

Массовая культура бактерий на твердой среде имеет ряд преимуществ по сравнению с культурой в жидкой среде (гл. 10).

1. В случае культур, выращенных на твердой среде, нет необходимости использовать центрифугу или другие средства для сбора клеток, поскольку в этих культурах клетки находятся уже в сконцентрированном состоянии. Вместо этого на поверхность агара пипеткой наливают небольшое количество стерильного солевого раствора или буфера и суспендируют в нем выросшие колонии с помощью стерильного стеклянного шпателя. Таким способом можно получить большое количество клеток с поверхности агаровых сред в чашках Петри, в больших плоских культуральных матрасах (бутылях типа PY) и в больших плоских чашках (покрытых крышками из пирекса). Особенно следует избегать центрифугирования при получении большого количества патогенных или других вредных бактерий, поскольку при этом образуются аэрозоли.

2. Твердые культуры относительно свободны от мак-ромолекулярных компонентов и полностью свободны от частиц питательной среды, так как последние обычно находятся внутри агарового геля. Более того, твердые культуры относительно свободны от низкомолекулярных питательных веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов, поскольку для их растворения необходимы значительно большие объемы среды. Следовательно, культуры, выращенные на твердой среде, особенно полезны для приготовления антигенов или для других целей, когда важна чистота клеточной суспензии.

3. На твердых культурах можно получать результаты, которые невозможно достичь другим путем. Например, плодовые тела миксобактерий и эндоспоры определенных видов Bacillus образуются только при росте культур на твердой среде. Это объясняется тем, что лишь здесь бактерии сохраняют между собой физические связи, а также тем, что в данном случае обеспечивается максимальное снабжение кислородом из атмосферы и вымывание продуктов метаболизма (например, кислот) из клеточного окружения. Если этого не происходит, рост культуры подавляется.

Вместе с тем выращивание бактерий на твердых средах по сравнению с культивированием в жидкой среде им

страница 66
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(13.12.2017)