трихи на поверхности среды в секторе 3. Д. Инкубируют опрокинутые вверх диом чашки, как показано на рисунке, для того чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала иа поверхность агара. В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии.

Даже в таком случае необходимо какое-то время, чтобы удалить из сосуда кислород и создать там анаэробные условия. Однако если применяют метод вращающихся пробирок, содержащих предварительно восстановленные среды, то это не требуется [27—29]. Пробирки с предварительно восстановленной расплавленной средой вращают таким образом, что агар затвердевает тонким слоем на их стенках. Метод посева штрихом во вращающуюся пробирку иллюстрирует рис. 8.2. Среду в такой пробирке инокулируют разведенной суспензией клеток и затем вращают пробирку для распределения клеток по поверхности агара (см. также разд. 6.6.4).

8,4.2. Последовательные разведения в твердой среде

Самый простой способ посева с помощью разлива по чашкам заключается в том, что после инокуляции испытуемой пробы в пробирку со стерильным расплавленным агаром (охлажденным до 45—50°С) среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Однако, чтобы получить хорошо изолированные колонии, часто возникает необходимость разведения проб. Наилучшие результаты получают при использовании последовательных десятикратных разведений исходных проб. По 1 мл каждого разведения вносят в чашки Петри, добавляют 15—20 мл расплавленной агаровой среды, смешивают, покачивая чашки несколько раз, и дают среде затвердеть. При выделении анаэробов разведения смешивают с расплавленной, охлажденной и предварительно восстановленной средой во вращающихся пробирках непосредственно перед покрытием ею стенок пробирок.

Недостатком разведения в расплавленной агаровой среде является то, что отдельные колонии оказываются погруженными в агар и поэтому извлечь их можно только механически — стерильным инструментом или отсасыванием с помощью пастеровской пипетки. Плохо также то, что бактерии некоторое время находятся в среде при температуре расплавленного агара (45—50°С).

Для выделения анаэробов, особенно фототрофов и сульфатредуцирующих бактерий, часто используют метод глубинного посева со встряхиванием пробирок [76]. Для этого готовят серию стерильных пробирок, помещают их в водяную баню при 45 °С и наполняют до половины расплавленной агаровой средой той же температуры. Инокулируют первую из пробирок несколькими каплями смешанной культуры и осторожно размешивают со средой. Затем 1/10 объема среды переносят во вторую пробирку. В это время нижнюю часть первой

Рис. 8.2. Посев во вращающиеся пробирки в анаэробных условиях [27]. / — проволочная петля из платины или нержавеющей стали (нихром может вызывать окисление среды); 2 — газовая канюля для постоянного продувания через пробирку газа, не содержащего кислород, 3 — предварительно восстановленная агаровая среда, покрывающая внутреннюю поверхность пробирки; 4 — соединяющийся с мотором держатель для вращения пробирки во время нанесения штриха. Петлю с инокулятом опускают на дно пробирки, прижимают плоскость петли к поверхности агара и поднимают ее вверх. После нанесения на агар штриха таким образом в нижней четверти пробирки плоскость петли ставят перпендикулярно поверхности агара (как показано на рисунке) и продолжают наносить штрих до верхней части пробирки. Удаляют газовую канюлю, закрывают пробирку резиновой пробкой и инкубируют в вертикальном положении.

пробирки погружают в вертикальном положении в холодную воду для затвердения агара. Размешивают содержимое второй пробирки и переносят 1/10 объема ее среды в третью пробирку, а вторую пробирку охлаждают. Таким же образом поступают с оставшимися пробирками. После этого в каждую пробирку с затвердевшим агаром наносят сантиметровый слой расплавленной стерильной смеси (1:1) парафина и вазелинового масла, благодаря чему среда предохраняется от контакта с воздухом. В процессе затвердения парафиновый слой может сжиматься, и тогда он перестает выполнять свою защитную функцию. В этом случае следует применить слабое локальное нагревание, а также проколом удалить воздушные пузырьки из-под парафинового покрытия. Когда бактерии вырастают, выбирают пробирку с хорошо изолированными колониями и удаляют из нее столбик агара. Для этого вначале расплавляют и снимают парафиновый слой, а затем вводят между стенкой пробирки и агаром стерильную капиллярную пипетку. Кончик пипетки опускают до дна пробирки и вдуванием воздуха выталкивают агаровый столбик из пробирки в стерильную чашку. Чтобы получить колонии, агар разрезают на кусочки.

8.4.3. Последовательное разведение

в жидкой среде

Этот метод применяют в том случае, если выделяемый микроорганизм не растет на твердой среде. При этом данный микроорганизм должен количественно преобладать в смешанной популяции. Готовят раствор смешанной культуры таким образом, чтобы при добавлении аликвот в большое число пробирок с питательной средой среднее число инокулированных бактерий было бы менее 0,05 на пробирку. Это достигается, например, при инокуляции 1-миллилитровых аликвот в 100 пробирок из 100 мл раствора, содержащего всего 5 бактерий. При инкубации в большинстве пробирок роста бактерий не происходит, но в те несколько пробирок, где наблюдается рост, вероятно, попала лишь одна бактерия (Р —0,975). Чем меньше среднее число бактерий, инокулированных в пробирку, тем больше вероятность того, что культура выросла из единственной бактериальной клетки. Следовательно, в большинстве инокулированных пробирок роста быть не должно, тогда в тех нескольких пробирках, где рост наблюдается, вероятность инокулирования среды единственной клеткой очень высока. Обсуждение теоретических аспектов этого метода приводится в работе [51].

8.4.4. Выделение отдельных клеток

Обзор различных методов выделения отдельных клеток можно найти в работе [36]. При необходимости регулярного многократного выделения рекомендуется применять микроманипулятор. Для эпизодических выделений используют следующий метод, описанный Ледербер-гом [42J.

На нижней стороне чистого предметного стекла тушью чертят сетку квадратов со стороной 5 мм. Верхнюю сторону стекла стерилизуют над пламенем горелки. После охлаждения стекла его покрывают слоем вазелинового масла толщиной 0,5 мм (стерилизовать масло нет необходимости). Нагревают стеклянную трубку диаметром 4 мм в пламени и вытягивают один ее конец так, чтобы получился капилляр диаметром около 0,1 мм. На другой ее конец надевают резиновую трубку. Разводят культуру до плотности 106—107 клеток бактерий в 1 мл среды и, сжимая резиновую трубку, насасывают суспензию в капилляр. Помещают в центр каждого квадрата каплю суспензии из капилляра под масло. Капли прилипают к стеклу и расплющиваются до диаметра 0,1—0,2 мм. Сканируют стекло с помощью фазово-контрастной или темнопольной микроскопии и определяют, в какой из капель содержится только одна клетка выделяемого микроорганизма. Часто такую единичную клетку извлекают путем многоразового набирания и выпускания капли капиллярной пипеткой, содержащей стерильную среду.

По другой методике к капле добавляют примерно 10 мкл стерильной среды и инкубируют на предметном стекле в закрытой камере до появления клона бактерий, а затем извлекают несколько клеток капиллярной пипеткой. Поскольку рост клона происходит в полуанаэробных условиях, эта методика неприменима для строгих аэробов.

8.5. СРЕДЫ И РЕАКТИВЫ

8.5.1. Среда для выделения

Aquasplrillum graclle [12]

Пептон Дрожжевой

ракт Твин 80

экст5 г 0,5 г

0,02 г

К2НР04 0,1 г

Агар 10 г

Дистиллированная 1000 мл

вода

Доводят рН до 7,2. Нагревают среду до кипения для растворения агара. Стерилизуют 15 мин при 121 °С.

8.5.2. Среда ASN-HI [59]

NaCl 25 г

MgCl2-6H20 2 г

КС1 0,5 г

NaN03 0,75 г

K2HP02-3H20 0,02 г

MgS04-7H20 3,5 г

CaCl2-2H20 0,5 г

Лимонная кислота 0,003 г

Железоаммонийцитрат 0,003 г

ЭДТА, двунатриевая магниевая соль 0,0005 г

Na2C03 0,02 г

Смесь микроэлементов А5 (см. среду BG-11, 1 мл

разд. 8.5.8)

Деионизованная вода 1000 мл

После автоклавирования и охлаждения рН среды должен быть 7,5.

8.5.3. Среда для Azotobacter

Маннит 2 г FeS04-7H20 0,1 г

К2НРО4 0,5 г Дистиллированная 1000 мл

MgS04'7H20 0,2 г вода

Доводят рН до 7,3—7,6. Стерилизуют 15 мин при 121 °С.

8.5.4. Основная среда для получения накопительных культур Rhodospirillaceae [76]

Раствор А:

NaHCOa 2 г

Дистиллированная вода 25 мл

Стерилизуют фильтрованием (положительное давление). Раствор В:

NH4CI I г

КН2Р04 0.5 г

MgCl2 0,5 г

NaCl (для организмов из солоноватой или морской (20—30 г)

воды)

Раствор микроэлементов (см. ниже) 1 мл

Дистиллированная вода 975 мл

Стерилизуют в течение 15 мин при 121 *С.

Раствор С:

Na2S9H20 3 г

Дистиллированная вода 200 мл

Стерилизуют в колбе с магнитной мешалкой в течение 15 мин при 121 °С. После охлаждения добавляют, помешивая, 1,5 мл стерильной 2 М H2S04.

Для приготовления среды растворы А и В объединяют. Доводят рН до 7 с помощью стерильных растворов Na2C03 и Н3РО4. При инокуляции первичных накопительных культур на 100 мл среды добавляют 1 мл раствора С. При последующих пересевах начавшей расти культуры Rhodospirillaceae исключают из среды Na2S и заменяют MgS04 на MgCl2.

Раствор микроэлементов:

ЭДТА, двунатриевая 500 мг СоС12-6Н20 20 мг

соль СиС12-2Н30 1 мг

FeS04-7H20 200 мг NiCI2-6H20 2 мг

ZnS04-7H20 10 мг Na2Mo04-2H20 3 мг

МпС12-4Н20 3 мг Деионизованная вода 1000 мл

НзВОл 30 мг

ЭДТА растворяют в порции воды. Отдельно растворяют в воде другие ингредиенты и добавляют их к раствору ЭДТА. Доводят рН раствора приблизительно до 3, а объем до 1 л.

8.5.5. Основные неорганические среды А и В [14]

Среда А

Раствор 1:

(NH4)2S04 СаС12-2Н20 MgS04-7H20 Цитрат железа Дистиллированная вода

Стерилизуют 15 мин при 121 °С

Раствор 2:

К2НР04 КН2Р04 Дистиллированная вода

Стерилизуют 121 °С

0,2 г 0,1 г 200 мл