Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

щих его бактерий [14]

Для получения накопительных культур бактерий, окисляющих толуол, используют основную неорганическую среду А или В (разд. 8.5.5) в закрытых ватными пробками колбах. Среду инокулируют небольшим количеством влажной почвы, предварительно обработанной в течение нескольких дней парами толуола, или свежей почвой. Колбы инкубируют 1—3 нед при 25—30 °С в закрытой камере, содержащей стакан с водой, насыщенной толуолом. Отдельные колонии получают, делая посев выросшей культуры штрихом на твердую среду и инкубируя чашки при 25—30 °С в атмосфере, содержащей толуол.

8.2.33. Бактериальные клетки как субстрат для миксококков

Виды Myxococcus способны с помощью литических ферментов лизировать клетки других бактерий и использовать высвобождающиеся при этом вещества для своего роста. Можно воспользоваться этой особенностью при выделении миксококков из проб почвы, воды или растительного материала [47, 55, 66}. Бактериальные клетки, используемые в качестве субстрата (пригодны Enlero-bacter aerogenes), получают, либо снимая целую колонию диаметром 4 мм с поверхности агаровой среды, либо центрифугируя бактерии, выросшие в жидкой среде и отмывая их несколько раз. На поверхность водно-агаровой среды (1,5% агара в дистиллированной воде) миксококки высевают полоской или мазком около I см шириной и 4 см длиной. Мазок должен быть достаточно толстым, чтобы его можно было видеть невооруженным глазом. На один конец мазка помещают две или три частицы почвы или кусочки растительного материала, например коры или листьев. Через 2—3 дня и затем с однодневными интервалами исследуют чашки с помощью препаровальной лупы, чтобы убедиться в растворении бактериального мазка вокруг добавленных частиц. Следят также за появлением на мазке и по его краям плодовых тел обычно желтого, оранжевого или розового цвета. Плодовые тела, обнаруженные на наибольшем расстоянии от мазка, переносят на агаровую среду, содержащую 0,2% триптона или казитона (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) и 1,5% агара. Перед посевом для высвобождения миксоспор каждое плодовое тело раздавливают в капле стерильной воды между двумя предметными стеклами.

Добавление циклогексимида (25 мкг/мл) в непитательную агаровую среду и в последующие среды задерживает рост грибов, способствуя таким образом выделению миксококков [55].

8.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

8.3.1. Бактериальный паразитизм бделловибрионов [75]

Крошечные вибрионы, названные бделловибрионами, способны прикрепляться к различным грамотрицатель-ным бактериям, проникать через их клеточную стенку и размножаться в периплазматическом пространстве с последующим лизисом бактерии-хозяина. Метод выделения бделловибрионов во многих отношениях напоминает метод, используемый для бактериофагов.

500 г почвы суспендируют в 500 мл водопроводной воды и энергично встряхивают в течение 1 ч. Суспен зию центрифугируют 5 мин при 500 g для осаждения больших частиц. Надосадочную жидкость пропускают через мембранные ультрафильтры, постепенно уменьшая размер пор в следующем порядке: 3; 1,2; 0,8; 0,65 и 0,45 мкм. 0,5 мл полученного фильтрата смешивают с 0,5 мл суспензии (^5-1010 клеток в 1 мл) бактерий-хозяев (Enterobacter aerogenes или Pseudomonas fluorescens). Эту смесь добавляют к 4 мл расплавленной полужидкой среды YP (разд. 8.5.60), перемешивают и наливают на поверхность твердой YP-среды в чашки. После инкубирования в течение ночи проверяют появление на среде бляшек (областей литиса). Если они образуются в течение 24 ч, то это более характерно для

т

бактериофагов, чем для бделловибрионов, которые обнаруживаются не ранее чем через 2 сут. Бляшки, в которых предполагают присутствие бделловибрионов, срезают и суспендируют в УР-среде. Затем готовят серию разведений для наслаивания на газоны бактерий-хозяев с целью получения изолированных бляшек. Одну из бляшек исследуют фазово-контрастной микроскопией с целью найти очень подвижные крошечные вибрионы шириной около 0,3 мкм. Материал, полученный из бляшек, суспендируют в YP-бульоне, суспензию пропускают через ультрафильтр с диаметром пор 0,45 мкм, фильтрат разводят и наносят его на газоны бактерий-хозяев. После трех последовательных выделений из бляшек можно считать, что полученные штаммы бделловибриона вырастают из одной клетки.

8.3.2. Симбиоз растений с ризобиями [5]

Клубеньки, образуемые на корнях бобовых растений, представляют собой природную накопительную систему симбиотических азотфиксирующих бактерий рода Rhi-zobium. Корни люцерны или красного клевера, содержащие клубеньки, отмывают от земли. Отделяют клубеньки от корня так, чтобы небольшая часть корня оставалась с клубеньком. С помощью волосяной щетки промывают клубеньки водопроводной водой, удаляя остатки земли, и погружают их в раствор HgCh (1 : 1000) на 3—6 мин, время от времени переворачивая стерильным пинцетом. Переносят клубеньки в 75%-ный этанол и несколько минут встряхивают. Затем помещают их в стерильную воду и взбалтывают смесь еще несколько минут. Наливают по 1 мл стерильной воды в шесть стерильных чашек Петри. В первую чашку кладут клубенек, раздавливают его стерильным пинцетом и добавляют к нему воду. Переносят 1—2 петли полученной суспензии во вторую чашку со стерильной водой и перемешивают. Проводят суспензию таким же образом через оставшиеся чашки. К каждому разведению добавляют расплавленный и остуженный до 45 °С агар с дрожжевым экстрактом и маннитом (разд. 8.5.59). Инкубируют чашки с затвердевшей средой при комнатной температуре и получают затем субкультуры из отдельных колоний.

8.3.3. Заражение животных для получения культур Streptococcus pneumoniae [20]

Патогенный микроорганизм можно выделить, иноку-лируя животное-хозяина смешанной культурой, в которой он находится. В инфицированном животном патогенный микроб преобладает и часто обнаруживается в виде чистой культуры в крови и тканях. При этом в результате действия защитных механизмов животного рост непатогенных сопутствующих микроорганизмов ин-гибируется или они гибнут.

Например, чистую культуру пневмококков можно получить через 4—6 ч после внутрибрюшинного введения мыши 1 мл эмульгированной мокроты, содержащей 5. pneumoniae и другие бактерии. Пробы перитонеаль-ной жидкости берут из брюшинной полости животного с помощью стерильной остроконечной капиллярной пипетки.

8.3.4. Инфицирование животного возбудителем чумы Yersinia pestis

Выделение из разлагающихся трупов животных Yersinia pestis затруднено из-за присутствия большого количества бактерий, вызывающих гниение. Для получения накопительных культур У pestis разлагающийся материал втирают в выбритую кожу живота морской свинки. Благодаря малым размерам клетки У. pestis быстро проникают через микроскопические царапины на бритой коже и инфицируют животное, тогда как большинство сопутствующих бактерий имеют размеры, не позволяющие им проникать через кожу. Чистые культуры У. pestis можно получить, вырастив материал, полученный из бубонов и селезенки животных.

8.4. ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры. Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии

8. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

Могут вырасти не только из отдельных клеток, но из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то к ней часто прикрепляются посторонние формы. В случае выделения штаммов Bacillus или актиномицетов контаминирующие микроорганизмы могут быть опутаны цепочками клеток или соответственно гифами этих бактерий. Для очистки предпочтительнее использовать неселективную среду, поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить. Но даже на неселективной среде не следует очень быстро отбирать колонии, поскольку за данный отрезок времени могут еще не вырасти медленно растущие контаминирующие бактерии.

Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при микроскопировании выявляются похожие клетки, в частности по размеру и окраске по Граму. Однако возможны исключения, например, колонии, вырастающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться кокковид-ные клетки, цисты и споры. Наконец, некоторые микроорганизмы проявляют грамвариабельность. Тем не менее указанные критерии широко используются при определении чистоты культур.

8.4.1. Посев штрихом или разливом на твердую среду

Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами («штрихованные чашки»), но лишь один из них (рис. 8.1) почти всегда дает хорошо изолированные колонии даже при отсутствии навыков у экспериментатора. Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках (подробности метода приведены в разд. 11.2.1). При работе с анаэробами «штрихованные чашки» или чашки с внесенной в них жидкой культурой в атмосфере воздуха инкубируют затем в анаэростате. Для анаэробов необходимы свежеприготовленные среды, и посев штрихом следует проводить в течение первых 4 ч после их автоклавирования, чтобы избежать накопления растворенного кислорода.

г

д

Рис. 8.1. Удобный метод посева штрихом в чашки для получения отдельных колоний. Л. Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно иа 3 сектора. Б, Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности агара в секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 с). В. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 1, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пламени и дают ей остыть. Г. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом ш

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.09.2017)