Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

аэробами, способны гидролизовать и сбраживать агар. Эту особенность используют для получения их накопительных культур. Бутыли со стеклянными пробками или пробирки с завинчивающимися крышками наполняют доверху нестерильной средой Велдкампа (разд. 8.5.55). Среду инокулируют илом, взятым на морском берегу в местах, где гниют водоросли, бутыли закрывают и инкубируют их в темноте при 30 °С. В течение 3—7 дней следят за появлением мутности, образованием газа и падением рН. Отдельные колонии получают с помощью встряхивания пробирок со стерильной средой Велдкампа, содержащей 2% агара. Следят за образованием колоний, в которых при микроскопировании обнаруживаются подвижные изогнутые формы, что характерно для ци-тофаг. Способность бактерий из этих колоний размягчать или разжижать агар проверяют пересевом их на среды, содержащие 1 % агара и 1 °/о дрожжевого экстракта.

8.2.27. Лактат как субстрат для пропионовокислых бактерий

Основой для селекции пропионовокислых бактерий является их способность сбраживать лактат. Пробирку с завинчивающейся крышкой (вместимостью 25 мл) заполняют свежепрокипяченной и охлажденной средой, содержащей 4% лактата натрия и 1% дрожжевого экстракта. Добавляют около 0,2 г СаС03 и среду инокулируют маленьким кусочком швейцарского сыра. Завинчивают крышку пробирки и инкубируют ее при 30 °С. Следят за образованием красно-коричневого помутнения, которое появляется примерно через 5—7 дней. Отдельные колонии получают рассевом культуры штрихом на стерильный агар с лактатом и дрожжевым экстрактом с последующей инкубацией в анаэробных условиях в атмосфере, обогащенной С02, которая создается с помощью GasPak (BBL).

8.2.28. Аммоний или нитрит как субстраты для нитрифицирующих бактерий [50, 58]

Используют основную среду, описанную в разд. 8.5.38. Для бактерий, окисляющих аммоний до нитрита, в среду добавляют (NH4)2S04 (0,5 г/л); для бактерий, окисляющих нитрит в нитрат, используют среду, содержащую NaN02 (0,5 г/л). Готовят разведения почвы 1 : 10 и в каждую колбу со средой вносят по 1 мл разведенной суспензии. Инкубацию проводят при 28 °С и каждую неделю отбирают пробы из накопительных культур в специальные чашки, наблюдая за исчезновением из среды аммония или нитрита. Для выявления аммония в чашки добавляют 3 капли раствора Несслера (разд. 20.4.10). Если среда окрашивается в оранжевый или желтый цвет, это указывает на наличие в ней аммония. Для выявления нитрита к пробам (0,5 мл) добавляют по 3 капли растворов А и В (разд. 20.4.12). В этом случае красный цвет указывает на присутствие нитрита. Сравнивают интенсивности полученной окраски и окраски разведенных стандартных растворов аммония или нитрита и восполняют использованный в накопительной культуре субстрат добавлением в нее свежего стерильного основного раствора. Если в накопительной культуре совсем нет нитрита, то нитрат выявляют, добавляя к пробе небольшое количество цинкового порошка. Это следует делать после внесения реактивов для определения нитритов. Цинк восстанавливает присутствующий в среде нитрат до нитрита, который затем окрашивается в красный цвет. Продолжают инкубировать накопительную культуру и еженедельно вносят в нее аммоний или нитрит, до тех пор пока популяция нитрифицирующих бактерий не будет выявляться при микроскопировании.

Выделить чистую культуру нитрифицирующих бактерий чрезвычайно трудно. Для этого необходимо использовать среды, полностью лишенные органических веществ, причем колонии, образуемые этими бактериями, крайне малы (примерно 100 мкм в диаметре). Более того, нитрифицирующие бактерии растут очень медленно, и поэтому их культуры часто загрязняются другими микроорганизмами. Используя в качестве разбавляющего раствора стерильную среду для накопительных культур, готовят серию десятикратных разведений. По 1 мл из каждого разведения вносят в чашки Петри и затем добавляют силикагель, приготовленный на среде для накопительных культур в двойной концентрации, как описано в разд. 9.1.3. Быстро смешивают

ЗП

разведенные культуры со средой и дают ей застыть Чашки инкубируют во влажной атмосфере при 28 °С, периодически проверяя с помощью микроскопа образование крошечных колоний. Хорошо заметные колонии отбирают пастеровской пипеткой с вытянутым на пламени тонким кончиком и переносят их в стерильную среду. Способность субкультур использовать аммоний или нитрит, а также наличие посторонних микроорганизмов определяют, делая посев штрихом па такие органические среды, как питательный агар (при этом роста не должно быть). Любые, даже кажущиеся чистыми культуры проводят через силикагелевую среду несколько раз, отбирая хорошо видимые под микроскопом колонии и проверяя способность субкультур использовать аммоний или нитрит, а также наличие посторонних микроорганизмов.

8.2.29. Нитрат и органические кислоты как субстраты для псевдомонад

Некоторые виды Pseudomonas, относящиеся к аэробам, можно получить в виде накопительных и чистых культур, используя их способность расти на среде с нитратом как источником азота, а также с солями различных органических кислот в качестве источников углерода и энергии [74]. Для этого к 3 мл сукцинат-солевой среды (разд. 8 5 49) добавляют 0,1 г почвы или ила либо 0,1 мл прудовой или речной воды. Для получения накопительных культур псевдомонад, способных к флуоресценции, таких, как P. putida, P. fluorescens или P. aeruginosa, среду инкубируют при 30 °С. Для выделения P. aeruginosa инкубацию проводят при 41 °С (P. putida и P. fluorescens не растут при этой температуре). Накопительные культуры P. acidovorans получают, заменяя в среде гликолат, муконат или норлейцин на сук-цинат и инкубируя ее при 30 °С.

Некоторые псевдомонады используют в качестве терминального акцептора электронов не только кислород, но и нитрат. Поэтому их выделение проводят, увеличивая в ср^де концентрацию нитрата до 1 % и заполняя доверху средой пробирки с завинчивающимися крышками, поскольку лимитирование по кислороду способствует нитратному дыханию.

После получения вторичных накопительных культур псевдомонад делают посев штрихом в чашки с агаром (используют соответствующую среду с содержанием агара 15 г/л), где вырастают отдельные колонии. Чашки инкубируют в аэробных условиях при 30 °С.

8.2.30. Сульфат и органические кислоты как субстраты для сульфатредуцирующих бактерий

Представители анаэробного рода Desulfovlbrio и большая часть видов Desulfotomaculum окисляют лак-тат в присутствии сульфата, который при этом восстанавливается до H2S. Пробы почвы, ила, воды или фекального материала вносят в пробирки с завинчивающимися крышками или в сосуды с закрывающимися пробками, наливают в них доверху лактагную среду (разд. 8.5.24) и инкубируют при 30 °С. Почернение среды указывает на восстановление сульфата. Перед высевом на твердую среду проводят вторичное накопление. Спорообразующие бактерии, относящиеся к роду Desulfotomaculum, можно выделить, нагревая накопительную культуру перед высевом на твердые среды до 70 °С в течение 10 мин. Для получения отдельных колоний сульфатредуцирующих бактерий делают посев штрихом в чашки со средой Иверсона (разд. 8.5.23) и выдерживают их 7—10 дней в атмосфере водорода при 30°С.

Для получения накопительных культур Desulfotomaculum acetoxldans [81], которая использует не лактат, а ацетат, применяют среду Виддла и Пфеннига (разд. 8.5.57), содержащую ацетат С помощью фазово-контрастной микроскопии следят за появлением подвижных прямых или слегка изогнутых палочек толщиной 1 —1,5 мкм и длиной 3,5—9 VTKM, которые имеют споры, а также яркие преломляющие участки. Для получения отдельных колоний используют метод встряхивания пробирок. После 3 нед инкубации колонии отбирают и нагревают 10 мин при 70 °С; такая тепловая обработка помогает выделению D acetoxldans, который является спорообразующим микроорганизмом.

8.2.31. Сера как субстрат для Desulfuromonas acetoxidans [56]

D. acetoxidans получает энергию для своего роста в результате анаэробного дыхания, используя в качестве источников углерода и энергии ацетат, этанол или пропанол, а как акцептор электронов — серу. Пробы анаэробных вод, содержащих сульфид, или ила из пресного или морского водоема вносят в стерильные сосуды с завинчивающимися крышками, которые заполняют средой Пфеннига и Библа (разд. 8.5.39), оставляя небольшое воздушное пространство. После завинчивания крышек сосуды инкубируют 1 нед при 28 °С с перемешиванием (например, на круговых качалках со скоростью 150 об/мин). Наличие стеклянных бусинок в среде обеспечивает постепенное размельчение серы в очень тонкую суспензию. Рост бактерий определяют по сильному запаху H2S. После двух пересевов на среду Пфеннига и Библа с добавлением раствора витаминов (разд. 8.5.57) сере дают осесть и проверяют, действительно ли наличием клеток объясняется легкая мутность надосадочной жидкости. В микроскоп должны быть видны небольшие палочки размером 0,4—0,7X1—4 мкм, причем некоторые из них могут двигаться. Отдельные колонии получают методом глубинного посева в пробирки с последующим встряхиванием. Для хорошего гомогенного распределения серы в пробирках с агаром к 50 мл агаровой среды добавляют 3 капли автоклавиро-ванного раствора полисульфида (10 г Na2S-9H20 и 3 г порошка серы, растворенного в 15 мл дистиллированной воды). В процессе роста бактерий следят за изменением окраски колоний от розового до цвета охры.

Поскольку сульфид, образуемый D. acetoxidans, ин-гибирует рост данной бактерии (предельная концентрация H2S, которую она выдерживает, составляет 0,1%), был предложен альтернативный метод получения ее накопительной культуры, при котором среду, содержащую серу, инокулируют не только пробами ила и воды, но также чистой культурой зеленых серных бактерий из сем. Chlorobiaceae. Эти бактерии постоянно потребляют выделяемый в процессе роста D. acetoxidans H2S и окисляют его с образованием элементной серы, которая используется быстро растущей накопительной культурой D. acetoxldans. Такой метод можно применять и для выделения чистых культур D. acetoxldans [56].

8.2.32. Толуол как субстрат для окисляю

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.04.2017)