Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

м объемом среды Гизбергера, содержащей лактат, но лишенной NH4C1. Стерилизуют эту смесь автоклавированием, вносят в нее нестерильную исходную культуру и инкубируют Истощение среды по азоту проводят до тех пор, пока в культуре не будут преобладать спириллы. Отдельные колонии получают путем посева на агар MPSS (разд. 8.5.35).

Для получения накопительных культур спирилл используется также проточное (непрерывное) культивирование, при котором обеспечивается низкий уровень питательных веществ. Яннах [34] показал, что в условиях хемостата скорость роста морских спирилл выше скорости роста псевдомонад в смеси этих бактерий, если скорость разведения снижается до такой величины, при которой содержание лимитирующего источника углерода и энергии (лактата) становится ниже 10 мг/л. В других экспериментах скорость роста спирилл превышала скорость роста Escherichia coli, если концентрация лактата падала ниже 5 мг/л [35]. В подобных экспериментах с пресноводными спириллами и псевдомонадами Мэтин и Велдкамп [49] обнаружили, что при концентрации лактата ниже 0,09 мг/л псевдомонады исчезают из хемостата, так как они не растут. Эффективное использование спириллами лактата из среды может быть связано с более низким /См и более высокой Ушах их транспортной системы для данного субстрата по сравнению с другими микроорганизмами, а также с более высоким отношением у клеток этих бактерий поверхности к объему [49].

Оказалось, что в условиях голодания спириллы выживают лучше [48]. Вероятно, это связано с их способностью накапливать в клетках в качестве запасного вещества поли-р-оксибутират, если их предварительно выращивать на среде при лимитировании источниками углерода и энергии. Значение запаса поли-р-оксибутира-та для выживания клеток показано и для других бактерий [16]. Поэтому истощение среды можно рассматривать как путь для выделения бактерий, образующих этот полимер.

8.2.20. Разбавленная среда для получения культур Sphaerotilus [8]

Бактерии рода Sphaerotilus, образующие чехлы, встречаются в ручьях, загрязненных сточными водами или органическими веществами; они формируют слизистые «пряди», прикрепленные к погруженным в воду предметам. Эти микроорганизмы можно также выделить из рек, открытых водостоков или канав, в которых нет явных признаков их присутствия. Процедура получения накопительных культур Sphaerotilus основана на их способности расти при низком содержании питательных веществ. К 50 мл среды для Sphaerotilus (разд. 8.5.46), налитой в квадратные бутыли Френча добавляют 25 мл пробы воды или по 1, 5 и 10 мл отстоя сточных вод или отстоя жидкостей, полученных на различных стадиях обработки сточных вод. Смесь инкубируют 5 дней при 22—25 °С. Через 2 дня после начала инкубации ежедневно с помощью микроскопа следят за появлением нитей. Для получения чистой культуры собирают нити из накопительной культуры и рассевают их штрихом в чашках с твердой средой (0,05% мясного экстракта и 1,5% агара). Инкубируют чашки 24 ч при 25 °С и с помощью препаровальной лупы находят типичные извитые нити Sphaerotilus. Переносят их в трип-тиказо-глицериновый бульон [5 г триптиказы (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md.), 5 г глицерина и 1000 мл дистиллированной воды, рН 7,0—7,2] и инкубируют в нем до 2 нед. Через 2—3 дня Sphaerotilus образуют толстую поверхностную пленку, бульон же под ней остается прозрачным. Если в бульоне появляется помутнение, следовательно, он содержит другие микроорганизмы, но, даже если помутнения среды не происходит, для гарантирования чистоты следует вновь выделить Sphaerotilus из поверхностной пленки путем рассева штрихом на агар, приготовленный на мясном экстракте.

Если хотят убедиться в том, что выделенные микроорганизмы имеют чехлы, помещают небольшой кусочек образующейся слизи на предметное стекло в каплю воды, накрывают покровным стеклом и прижимают покровное стекло промокательной бумагой. На край покровного стекла помещают маленькую каплю 1%-ного кристаллического фиолетового, чтобы он просачивался в препарат по капиллярному принципу. Через 30 с промокают препарат бумагой, чтобы удалить избыток краски, и рассматривают его в микроскоп, используя иммерсионный объектив. Клетки и чехлы должны быть хорошо видны.

8.2.21. Триптофан как субстрат для псевдомонад [44]

Для получения накопительных культур псевдомонад, способных использовать триптофан как единственный источник углерода и азота, в 250-миллилитровую колбу Эрленмейера, содержащую 40 мл триптофановой среды (разд. 8.5.54), вносят около 0,1 г почвы, Смесь инкубируют на качалке в течение 5—7 дней при 25 °С. 0,1 мл культуры переносят в другую колбу со средой и инкубируют 2—3 дня. После следующего серийного пересева полученную чистую культуру рассевают штрихом на триптофановую среду с агаром (15 г/л). После 1— 3 дней инкубации делают посев из отдельных колоний на агаровые косяки.

8.2.22. N2 как субстрат для Azospirillum и Azotobacter

Azospirillum — это микроаэрофильный азотфиксатор, ассоциированный с корнями различных растений; его находят также в почве [17, 18]. Отмытые кусочки корней длиною 5—8 мм, размягченные с помощью пинцета, помещают в безазотную полужидкую среду (среда Nfb; разд. 8.5.37). Среду можно также инокулировать почвой. Не перемешивая, инкубируют 40 ч при 32 °С и затем проверяют способность накопительной культуры восстанавливать ацетилен (тест на способность к азот-фиксации; разд. 20 2.7). Стараются не повредить плотную пленку под поверхностью среды, поскольку это может снизить активность нитрогеназы. Если культура восстанавливает ацетилен, то продолжают проводить ее накопление с помощью пересевов на свежую среду Nfb С помощью микроскопа находят толстые, извитые, подвижные палочки шириной около 1 мкм, заполненные гранулами поли-р-оксибутирата, и рассевают их штрихом в чашки со средой Nfb, содержащей 1,5% агара и 20 мг дрожжевого экстракта на 1 л. Через педелю находят маленькие, белые, плотные колонии и переносят их на полужидкую среду Nfb. Для окончательной очистки культуру из среды Nfb наносят штрихом на агар BMS (разд. 8.5.10), где следят за образованием типичных розовых, часто складчатых колоний

В отличие от Azospirillum, который в условиях фиксации азота является облигатным аэрофилом, у Azotobacter имеются механизмы защиты кислородочувстви-тельной нитрогеназы от кислорода. Поэтому Azotobacter может фиксировать молекулярный азот в аэробных условиях. 0,1 г почвы вносят в однолитровую колбу со 100 мл лишенной азота среды для Azotobacter (разд.

8.5.3) и инкубируют с перемешиванием при 30 °С. Периодически культуру микроскопируют, чтобы выявить большие яйцеобразные клетки диаметром 2 мкм или более. Получают вторичную накопительную культуру и очищают ее, делая пересев отдельных колоний на агаровую среду, лишенную соединений азота (среда для Azotobacter с 1,5% агара).

8.2.23. Метанол как субстрат для гифомикробов [9]

Представители рода Hyphondcrobium способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии такие одноуглеродные соединения, как метанол и метиламин. К 5 мл воды из пруда или канавы либо 0,3 г ила или почвы (предпочтительно с низким содержанием органических веществ) в закрывающихся сосудах емкостью 75—125 мл добавляют нестерильную среду для Hyphomicrobium (разд. 8.5.22), через которую продувается молекулярный азот для создания анаэробных условий. Сосуды доливают средой доверху и инкубируют в темноте при 30 °С. Следят, чтобы сосуды оставались заполненными, добавляя в случае необходимости свежую среду. Обычно развитие гифомикробов происходит примерно в течение 8 дней. С помощью фа-зово-контрастной микроскопии находят палочкообразные клетки с заостренными концами овальной, яйцевидной или бобовидной формы, которые образуют нитчатые выросты (гифы) различной длины, способные ветвиться. Для вторичной накопительной культуры используют свежую стерильную среду. Чтобы выделить отдельные колонии, клетки штрихом высевают на твердую среду (разд. 8.5.22) и инкубируют в аэробных условиях.

8.2.24. Н2 как субстрат для Aquaspirillum autotrophicum [7]

Воду из эвтрофного озера фильтруют через мембранные фильтры, которые помещают на минеральную агаровую среду (разд. 8.5.30) в чашках, и инкубируют ее при 30°С в атмосфере следующего состава: 60% Н2, 30% воздуха и 10% С02. Чистые культуры получают

8. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И чистых КУЛЬТУР

повторным рассевом штрихом культур в чашки с минеральной агаровой средой. Находят спириллы шириной 0,6—0,8 мкм со жгутиками на обоих концах клетки. Автотрофность в отношении водорода подтверждается тем, что в отсутствие органических веществ для роста культуры необходимо присутствие Н2 и С02.

8.2.25. Целлюлоза как субстрат для цитофаг

Для получения накопительных культур цитофаг, разлагающих целлюлозу, на поверхность основного минерального агара (разд. 8.5.6) помещают кусочки фильтровальной бумаги Ватмак № 1. На фильтровальную бумагу кладут частицы почвы или растительного материала и инкубируют чашки при комнатной температуре. Следят за образованием вокруг частиц желтой, оранжевой или розовой окраски, а также за процессом лизиса целлюлозы (бумаги). С помощью фазово-контрастной микроскопии можно обнаружить небольшие подвижные клетки цитофаг. Для выделения цитофаг, которые разлагают не только целлюлозу, культуру рассевают штрихом на агар с триптоном. Отдельные колонии цитофаг, разлагающих только целлюлозу, получают в чашках, заполненных минеральной агаровой средой, содержащей густую суспензию тщательно измельченной целлюлозы (разд. 20.1.13). Для предотвращения движения бактерий, имеющих жгутики, следует использовать достаточно твердую среду (0,85—1% агара), но не настолько, чтобы в ней нарушалась характерная для цитофаг скользящая подвижность. Иногда полезно тонким слоем агара с целлюлозой покрывать основную минеральную среду в чашках; при этом лучше видны зоны просветления, образующиеся в результате лизиса целлюлозы.

8.2.26. Агар как субстрат

для Cytophaga fermentans и С. salmonicolor [77]

Морские микроорганизмы С. fermentans и С. salmonicolor, являющиеся факультативными ан

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.11.2017)