а как на грамположительные кокки фенилэтанол не действует. Эга среда пригодна, например, для выделения из проб кала коагулазоположительных стафилококков.

8.2.9. Ингибирование трифенилметановым красителем

для получения культур грамотрицательных бактерий и микобактерий

Обычно для подавления роста грамположительных бактерий достаточно добавления трифенилметановых красителей (кристаллический фиолетовый, основной фуксин, бриллиантовая зелень и малахитовый зеленый) в более низкой концентрации, чем для подавления роста грамотрицательных. Например, при концентрации в среде 1:4000 000 малахитовый зеленый подавляет рост Bacillus subtilis, а в концентрации 1:1 000 000 — рост стафилококков. Однако для подавления роста Escherichia coli или Salmonella typhi необходима концентрация этого красителя ~ 1 . 30 000—1 : 40 000 [21]. Бриллиантовая зелень используется для выявления колипо-добных бактерий [в составе бульона с желчью и лактозой (разд. 8.5.13)] и в нескольких селективных средах для Enterobacteriaceae, таких, как агар для салмонелл и шигелл (разд. 8.5.43) и агар с бриллиантовой зеленью (разд. 8.5.12). Кристаллический фиолетовый также используют для селекции Enterobacteriaceae, например в составе агара с желчью и фиолетовым красным (разд. 8.5.56) и агара Мак-Конки (разд. 8.5.27). Микобактерий очень устойчивы к этим красителям. Поэтому малахитовый зеленый часто включают в среды, используемые для выделения Mycobacterium tuberculosis (например, в среду Лёвенштейна — Иенсена; разд. 8.5.26), в целях подавления роста других бактерий.

8.2.10. Ингибирование солями

для получения культур стафилококков

Для выделения стафилококков в среду добавляют 7,5% NaCl (см. солевой агар с маннитом; разд. 8.5.28). При этой концентрации NaCl рост других бактерий подавляется.

8.2.11. Ингибирование солями

для получения культур галобактерий [23]

Красные галофильные палочковидные бактерии Halohacterium и кокки Halococcus можно обнаружить в очень соленых белковых продуктах, например на соленой рыбе. Они обитают в солеварнях, в морской воде (Мертвого моря) и в водоемах с очень высоким содержанием солей. Для оптимального роста этих экстремальных галофилов необходима концентрация NaCl ~25%. Они обычно не растут при концентрации NaCl ниже 15% и даже после кратковременной экспозиции в таких растворах гибнут. Поскольку при концентрации NaCl 20% и выше растут только галофилы, их селекция из природного материала осуществляется довольно просто. Подходящая среда для получения накопительных культур таких бактерий приведена в разд. 8.5.21. После внесения проб колбы инкубируют при 37 °С на качалка и затем получают отдельные колонии путем посева культуры в чашки с этой же средой, содержащей 2% агара. Чашки инкубируют при 37 °С в течение 3— 14 дней в пластмассовых коробках или мешках, предохраняющих среду от высыхания.

8.2.12. Ингибирование желчью

для получения культур энтеробактерий

Желчь или ее соли часто добавляют в культураль-ные среды для селекции энтеробактерий. Однако на средах с такими добавками способны расти не только кишечные бактерии, например, на чистой желчи может расти Yersinia pesiis [53]. Тем не менее до сих пор желчь используют в качестве важного селектирующего фактора при выделении грамотрицательных палочковидных энтеробактерий и энтерококков. Для селекции представителей сем. Enter oh act eriaceae желчь или ее соли добавляют к таким средам, как агар Мак-Конки (разд. 8.5.27), агар для салмонелл и шигелл (разд. 8.5.43), агар с желчью и фиолетовым красным (разд. 8.5.56) и многим другим. Для получения накопительных культур энтерококков [20] хорошей селективной средой оказался питательный агар с желчью (разд. 8.5.9).

8.2.13. Ингибирование пенициллином

для получения культур микоплазм

Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они устойчивы к высоким концентрациям пенициллина, который подавляет рост многих бактерий, имеющих клеточную стенку. Антибиотик используют в концентрации 194 ед./мл, добавляя его, например, к таким средам, как агар Е (разд. 8.5.17).

8.2.14. Ингибирование пенициллином

для получения культур Bordetella pertussis

Полученные с помощью тампонов пробы из носоглотки суспендируют в бульоне и затем рассевают в чашки с агаром Борде — Жангу (разд. 8.5.11), содержащим пенициллин (0,5 ед/мл). Пенициллин способствует подавлению роста обычно содержащихся в таких пробах микроорганизмов, но нг мешает В. pertussis образовывать (в течение 4 дней) характерные жемчужно-серые (типа «ртутной капли») колонии.

8.2.15. Набор антибиотиков для получения культур Campylobacter fetus [68, 69]

Добавление бацитрацина (2 ед./мл) и новобиоцина (2 мкг/мл) к среде с агаром для бруцелл (разд. 8.5.14) позволяет выделять С. fetus из испражнений и кишечного содержимого крупного рогатого скота, овец, свиней и птиц. Этот метод можно использовать вместе с методом фильтрации, описанным ранее для получения накопительных культур С. fetus (разд. 8.1.16).

8.2.16. Набор антибиотиков для получения культур Neisseriae

Добавление к агару Тэйера—Мартина (разд. 8.5.52) ванкомицина, колистина и нистатина позволяет выделить Neisseria meningitidis из слизи носоглотки или N.gonorrhoeae из отделяемого уретры и шейки матки, так как эти антибиотики способствуют подавлению роста остальной микрофлоры.

8.2.17. Обработка формальдегидом для получения культур Gallionella ferruginea [54]

Микроаэрофильный хемолитотроф G. ferruginea встречается в холодных железистых водах, где он образует характерные изогнутые стебельки, покрытые окисью железа. В прямоугольную молочную бутылочку с завинчивающейся крышкой емкостью 150 мл, содержащую 10 мл агара с сульфидом железа и 100 мл жидкой среды, например модифицированной среды Вольфа (разд. 8.5.34), вносят 0,5 мл формалина (40%-ный раствор). Пробы, содержащие Gallionella из природных источников, центрифугируют 3 мин при 3000 g. 1—5 мл осадка вносят в сосуд со средой и инкубируют 1—2 дня при 25 °С. Формалин убивает сопутствующие бактерии, но не влияет на рост Gallionella, 1 мл обработанной формалином культуры переносят в сосуд со свежей средой, но без формалина и инкубируют при 25 °С, пересевая каждые 2—3 нед. Выделяемые бактерии образуют пушистые участки на поверхности агара, содержащего сульфид железа. Пробы из этих участков используют для получения субкультур. Чистоту культуры проверяют с помощью микроскопии и п>тем ее высева на другие среды, на которых Gallionella не растет,

8.2.18. Разбавленная среда для получения культур каулобактеров [57]

Каулобактеры представляют собой стебельковые бактерии, способные расти на средах с таким малым содержанием питательных веществ, которые не обеспечивают рост большинства других микроорганизмов. Пробы воды из прудов, ручьев, озер или даже водопроводной воды вносят в колбы или бутыли и добавляют к ним 0,01% пептона. Культуральные сосуды неплотно закрывают бумагой или алюминиевой фольгой и инкубируют при 20—25 °С. Ежедневно с помощью фазово-контрастной микроскопии рассматривают поверхностную пленку. После появления (обычно на 4-й день) стебельковых бактерий (1 на 10—20 клеток) делают посев из поверхностной пленки в чашки с агаровой средой, приготовленной на водопроводной воде с 0,05% пептона, и затем инкубируют их при 30 °С. В условиях низкого содержания пептона обеспечивается рост мелких колоний каулобактеров, но ингибируется рост других бактерий. Примерно через 4 дня (или более) исследованные с помощью препаровальной лупы кусочки среды с микроколониями каулобактера переносят в чашки со средой, содержащей 0,2% пептона, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,02% MgS04-7H20 и 1% агара. После двухдневной инкубации готовят на стеклах влажные препараты каулобактеров. Отдельные колонии пересевают с агара в чашки со свежей средой.

В случае морских каулобактеров к пробам морской воды добавляют 0,01% пептона и инкубируют их около 7 дней при 13 °С. Когда с помощью микроскопа обнаруживают достаточно большое число стебельковых бактерий, делают пересев из поверхностной пленки в чашки с агаром, приготовленным на морской воде с 0,05% пептона, и инкубируют их при 25 °С. Часть выросших микроколоний переносят в чашки со свежей средой и очищают их путем пересева.

8.2.19. Разбавленная среда для получения культур водных спирилл [83]

При росте в разбавленных средах аэробные хемоге-теротрофные спириллы (родов Aquaspirillum и Осеапо-spirillum) часто успешно конкурируют с другими бактериями за необходимые питательные вещества. Для выделения спирилл из пресных вод к пробам воды (например, из стоячих водоемов) добавляют 1 % пептона или дрожжевого автолизата и инкубируют их при комнатной температуре около 7 дней или до появления значительного количества спирилл. Часть исходной культуры добавляют к равному объему воды из того же водоема и смесь стерилизуют автоклавированием. В эту смесь вносят пробу из нестерилизованной порции исходной культуры. После инкубации и появления колоний спирилл часть вторичной культуры разводят водой из того же источника, смесь стерилизуют и инокулируют ее культурой из нестерилизованной порции. Продолжают такое разведение питательных веществ в среде до тех пор, пока в культуре не будут преобладать спириллы. Отдельные колонии спирилл получают путем посева культур в чашки с агаром MPSS (разд. 8.5.35).

Другой подход к выделению спирилл основан на использовании низкого содержания в среде источников азота [83]. При его применении к пробам воды добавляют малат или лактат кальция (1%) и инкубируют их при комнатной температуре около 1 нед. Затем производят серию пересевов в стерильную воду, содержащую 1 % источника азота, и снова инкубируют смесь. Процедуру пересева повторяют 3—4 раза до тех пор, пока в культуре не будут преобладать спириллы. Важно не добавлять в среду такие источники азота, как NH4CI, чтобы не допустить преимущественного роста сопутствующих бактерий.

В случае морских спирилл пробы морской воды смешивают с равными объемами основной среды Гизбер-гера (разд. 8.5.19), содержащей 1 % лактата кальция [83]. После инкубации отбирают часть культуры и смешивают ее с равны