Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

о тех пор, пока нити Beggiatoa не начнут мигрировать к периферии агара на достаточное расстояние от других микроорганизмов. Агаровые блоки, содержащие единичные изолированные нити, вырезают и помещают на поверхность свежей агаровой среды. После инкубации вновь выделяют отдельные нити. Процедуру селекции повторяют до тех пор, пока культура не станет свободной от других бактерий. Проверка чистоты культур проводится путем посева в различные среды

8.1.15. Использование фильтруемости трепонем для получения их культур [27, 70]

На поверхность агара в чашке Петри с соответствующей средой (разд. 8.5.42) помещают мембранный ультрафильтр с размером пор 0,15 мкм. На фильтр кладут кольцо диаметром 25—30 мм, слегка смазанное вакуумной смазкой. Затем на центральную часть мембранного фильтра наносят несколько капель разведенной пробы и инкубируют чашку в анаэростате при 37 °С в течение 1—2 нед. Трепонемы достаточно малы; они способны мигрировать через поры фильтра и проникать в расположенный под ним агар, где вызывают помутнение. Кольцо и мембранный фильтр снимают с поверхности агара, с помощью пастеровской пипетки удаляют поверхностный слой агара в области помутнения и микро-скопируют его в темном поле для выявления трепонем и контаминирующих форм. Методы субкультивирования и очистки культуры описаны в разд. 8.1.11. Подавлению роста сопутствующих бактерий часто способствует добавление в агаровую среду полимиксина В (800 ед./мл) и налидиксовой кислоты (800 ед./мл).

8.1.16. Использование фильтруемости

Campylobacter fetus для получения их культур [68, 69J

5 г фекальных масс или содержимого из кишечника крупного рогатого скота, овец, свиней или птиц разводят в 50 мл питательного бульона и фильтруют через несколько слоев марли, чтобы удалить крупные частицы. Используя в качестве предварительного фильтра рыхлую стеклянную вату, пропускают фильтрат через мембранный ультрафильтр с размером пор 0,65 мкм. Обмакивают стерильный ватный тампон в фильтрат и густо рассевают его в чашках с агаром для бруцелл (разд. 8.5.14). Чашки инкубируют при 37 °С в течение 4—5 дней в микроаэробных условиях (5% О2, 10% С02 и 85% N2). Подавлению роста других микроорганизмов способствует добавление в среду антибиотиков бацитра-цина (2 ед./мл) и новобиоцина (2 мкг/мл).

8.1.17. Использование фильтруемости

Aquaspirillum gracile для получения их культур [12]

На поверхность агара со средой для выделения (разд. 8.5.1) помещают мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм и наносят в центр этого фильтра 0,05 мл болотной или речной воды. Чашки инкубируют 1,5— 2 ч при комнатной температуре, затем снимают фильтр и продолжают инкубировать не менее 3 дней. Клетки Л. gracile имеют диаметр 0,2—0,3 мкм, т. е. они достаточно малы и способны проникать через поры ультрафильтра в агар. В агаре находят полупрозрачные области роста и делают из них пересев. Другие бактерии, имеющие малые размеры (мелкие вибрионы, кокки или короткие палочки), также способны проходить через ультрафильтры и образовывать колонии на поверхности ~реды, но их легко отличить от находящихся под поверхностью агара типичных полупрозрачных колоний Л. gracile.

8.1.18. Освещение при получении культур одноклеточных цианобактерий [59, 73]

Для выделения пресноводных цианобактерий (сине-зеленых водорослей) пробы из прудов, ручьев или водных резервуаров вносят в пробирки со средой BG-11 (разд. 8.5.8). Для выделения морских цианобактерий используют среду MN (разд. 8.5.32); если некоторые из них плохо растут на этой среде, то предпочтительнее пользоваться средой ASN-III (разд. 8.5.2). Всю стеклянную посуду следует вручную и хорошо прополаскивать водопроводной водой, концентрированной азотной кислотой и затем деионизованной водой. Накопительную культуру инкубируют в водяной бане на свету при 35 °С; при этой температуре подавляется рост большинства водорослей. Пользуются флуоресцентной лампой или лампой накаливания с освещенностью 2000 — 3000 лк. Для некоторых цианобактерий освещенность следует снизить до 500 лк или ниже. Накопление культуры периодически контролируют до тех пор, пока не убеждаются, что начался рост цианобактерий. Тогда их высевают на поверхность среды, содержащей 2% агара бактериологической степени очистки. Чашки инкубируют в условиях постоянной освещенности (<500 лк) при 25 °С на воздухе или в атмосфере, слегка обогащенной СОг; для предотвращения испарения в качестве камер следует использовать прозрачные пластмассовые коробки, например из-под овощей. С помощью препаровальной лупы выявляют компактные, сильно пигментированные колонии неподвижных циано бактерий. Для того чтобы избежать контаминации другими бактериями, может быть необходим многократный рассев культуры. При работе с подвижными цианобак-териями небольшую порцию культуры помещают на одну сторону чашки Петри с агаровой средой. Если освещать чашку с противоположной стороны, то цианобак-терии начнут перемещаться по поверхности агара в область с большей интенсивностью света. После того как часть микроорганизмов достигнет противоположной стороны чашки Петри, делают пересев в новые чашки столько раз, сколько это необходимо для того, чтобы избавиться от посторонних бактерий. Этот метод был также успешно использован для выделения некоторых нитчатых цианобактерий [73].

Для медленнорастущих цианобактерий, таких, как некоторые штаммы Pleurocapsales, исходную культуру можно получить прямым выращиванием колоний на твердой среде, что предпочтительнее, чем предварительное культивирование в жидкой среде [80]. Во время транспортировки обломков камней, раковин, моллюсков или обрывков крупных водорослей из зоны прилива в лабораторию образцы сохраняют в закрытых бутылях или пробирках, содержащих кусочек влажной фильтровальной бумаги. Образцы не следует погружать в морскую воду, так как это способствует развитию посторонних микроорганизмов. В лабораторных условиях делают соскобы с природных субстратов и суспендируют их в стерильной жидкой среде, а также рассевают в несколько чашек. Если в суспензии содержится много посторонних микроорганизмов, необходимо снизить их количество, прежде чем рассевать по чашкам. Для этого суспензию промывают несколько раз стерильной средой путем центрифугирования с низкой скоростью.

Для проверки чистоты культур цианобактерий пользуются микроскопом, а также инкубируют культуры на комплексных средах в темноте при 30 °С.

8.1.19. Освещение при получении культур Rhodospirillaceae [76]

Несмотря на то что представителей сем. Rhodospirillaceae относят к пурпурным несерным бактериям, ряд видов этого семейства может использовать в качестве донора электронов сульфид. Однако это происходит лишь в том случае, когда концентрация сульфида поддерживается на низком, нетоксичном уровне. Поэтому данные микроорганизмы обычно выращивают на средах с органическими донорами электронов. Используя различные источники углерода и витаминов, можно получить культуры тех или иных видов пурпурных бактерий. Как правило, в среду добавляют такие субстраты, которые не могут сбраживаться нефототрофными микроорганизмами.

Виды Rhodospirillaceae довольно легко выделяют из пресной воды и морских осадков; труднее изолировать их из почвы полей, газонов и садов. Для получения накопительных культур используют основную среду (разд. 8.5.4) с добавками, указанными в табл. 8.1. 0,1 г образца вносят в пробирку с завинчивающейся крышкой и полностью заполняют ее средой, так чтобы между средой и крышкой не было воздушного пространства. Инкубируют при 25 °С и при постоянном освещении лампой накаливания (50—75 Вт) с расстояния 40—60 см. Необходимо убедиться, что пробирка при этом не нагревается. В течение 3—7 дней наблюдают за увеличением мутности культуры, имеющей коричневую, желтую или розовую окраску. Затем переносят каплю культуры в другую пробирку со средой (табл. 8.1) для вторичного накопления. Для очистки культуры используют твердую среду, содержащую 1 % дрожжевого экстракта или пептона, 0,2% малата натрия и 1,5% агара. Засеянную среду разливают по чашкам Петри или в пробирки (разд. 8.4.2). Инкубацию проводят в анаэростате с постоянным освещением. Многие виды Rhodospirillaceae способны также расти в темноте в атмосфере воздуха или в микроаэробных условиях, однако в этих случаях колонии менее пигментированы, чем при их росте на свету в анаэробных условиях.

8.1.20. Освещение при получении культур Chromatiaceae и Chlorobiaceae

Фототрофные серобактерии, принадлежащие к сем. Chromatiaceae и Chlorobiaceae, культивировать значительно труднее, чем пурпурные несерные бактерии, хотя

их массовое развитие («цветение») дольно часто можно наблюдать невооруженным глазом, особенно в морской или солоноватой воде. Однако, если «цветения» не наблюдается, полезно для получения накопительных культур использовать колонку Виноградского. При этом обеспечиваются анаэробные условия и длительное снабжение H?S, что приводит к обильному росту фото-трофных серобактерий, впрочем как и многих других микроорганизмов.

Для приготовления колонки Виноградского используют ил из пресных, солоноватых или морских водоемов, например из береговой части прудов, ручьев, озер или соленых болот. Смешивают 3 части этого ила с од-лои частью CaS04-H20 и добавляют немного нерастворимых органических веществ в виде фильтровальной бумаги или корней водных растений. Если используют фильтровальную бумагу, то добавляют также небольшое количество NHUMgPO^ Смесь переливают в высокий стеклянный цилиндр диаметром не менее 5 см и высотой не менее 15 см к перемешивают ее так, чтобы не образовывались воздушные полости. Заполняют цилиндр водой (для выделения морских микроорганизмов используют морскую воду) и проводят инкубацию в темноте в течение 2—3 дней, чтобы свести к минимуму развитие фототрофных микроорганизмов, выделяющих кислород. Цилиндр оставляют при 18— 25 °С под лампой накаливания или при естественном освещении в течение всего периода инкубации. Анаэробный распад органического материала в колонке, сопровождающийся образованием С02, спиртов, жирных кислот, оксикислот и других органических к

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)