Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

e, 1974.

246. Zavarzin G, Legunkova R. J. Gen. Microbiol, 21, 186—190 (1959).

247. Zimmerman K-> Rogers K- B.r Frazer /, Boyce J. M. J. Pathol. Bacteriol, 96, 413-419 (1968).

Глава 8

ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

Н, Криг

В условиях естественного обитания чистые бактериальные культуры встречаются довольно редко. Тем не менее основная часть современных представлений о свойствах бактерий, а также их взаимоотношениях получена при изучении чистых культур. Поэтому часто возникает необходимость выделить в виде чистых культур различные виды бактерий, которые сосуществуют в естественных условиях. Накопление представляет собой основной этап процесса, который позволяет получить чистые культуры. Оно также дает возможность оценить различные воздействия факторов окружающей среды на смешанную микробную популяцию, благодаря которым может происходить отбор микроорганизмов, способных взаимодействовать со специфическими субстратами (или расщеплять их) или способных хорошо расти в необычных условиях.

Выделение чистой культуры данного микроорганизма будет успешным, если он присутствует в смешанной популяции в достаточно высокой пропорции. Микроорганизм легко выделить, если он количественно преобладает в смешанной популяции. Разработанные методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества данного организма благодаря созданию лучших условий для его роста и выживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения его от других членов популяции. К физическим методам, которые могут быть использованы в данном случае, следует отнести регуляцию роста температурой, тепловую обработку, ультразвуковую обработку и ультрафиолетовое облучение, приводящие к гибели или подавлению роста других организмов, присутствующих в популяции. Можно также использовать преимущества в некоторых физических свойствах изучаемого микроорганизма, таких, как его размеры и подвижность; это позволяет в значительной мере отделить данный организм от других в популяции. В химических методах используют токсичные вещества, которые убивают или подавляют рост оставшейся части популяции, не влияя на выделяемый микроорганизм. Кроме того, эти вещества могут быть источниками питания, используемыми преимущественно отдельными бактериями в смешанной популяции. Биологические методы включают использование специфических хозяев для выделяемого организма, а также преимуществ некоторых патогенных свойств микроорганизма (например, его инвазивность), которыми не обладают другие представители популяции. Во многих случаях для получения максимального эффекта накопления сочетают физические, химические и биологические методы.

Как правило, накопительные культуры получают в закрытых системах, т. е. микроорганизмы выращивают в обычных периодических (стационарных) условиях в колбах или пробирках, где концентрация питательных веществ и продуктов метаболизма постоянно изменяется в процессе их роста. Для получения накопительных культур используются также открытые системы. Например, с помощью хемостата можно обеспечить постоянство окружающей среды для бактерий, непрерывно подавая питательные вещества в концентрации, лимитирующей рост, и удаляя продукты метаболизма. Изменяя скорость разбавления среды в хемостате, можно контролировать концентрацию питательных веществ, лимитирующих рост. В свою очередь это может избирательно влиять на скорость роста различных организмов в смешанной бактериальной культуре, в результате чего один или другой организм смешанной популяции начинает количественно преобладать.

Из накопительных культур бактерии обычно выделяют путем их пространственного отделения от других форм на твердой среде, где они растут в виде колоний. Для микроорганизмов, не растущих на твердых средах, можно использовать метод предельного разведения, последовательно перенося клетки в отдельные пробирки с жидкой средой. Поскольку обычные методы выделения не дают абсолютной гарантии чистоты получаемых культур, некоторые исследователи применяют более сложные приемы, с помощью которых отдельную бактериальную клетку выделяют из смешанной популяции, используя для получения клона микроскопический контроль.

В этой главе мы приведем специфические примеры огромного многообразия и нередко изощренности методов накопления, используемых в бактериологии. Во многих случаях для получения накопительной культуры определенной бактерии используют несколько различных подходов. Основное внимание в этой главе будет уделено практическим аспектам получения накопительных культур и выделения бактерий, однако в конце главы приведены ссылки на общие обзоры [1—4], в которых можно найти подробную информацию об используемых при этом принципах. Получение накопительных культур и выделение мутантных штаммов рассматриваются в разд. 13.4—13.6.

8.1. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

8.1.1. Инкубация при низкой температуре

для получения культур психрофилов и психротрофов [52]

Поскольку низкая температура способствует задержке роста многих бактерий, но не влияет на рост психрофилов и психротрофов, прежде чем начать выделение бактерий, культуры инкубируют при температуре О— 5°С. Так, Ину [31] удалось изолировать психрофиль-ные бактерии из почвы Антарктиды, внеся разведенную суспензию бактерий в чашки с агаром, содержащим глюкозу, дрожжевой экстракт и пептон. Чашки инкубировали при температуре ниже 5°С в течение 14— 24 дней. Таким методом были получены девять штаммов бактерий с оптимальной температурой для роста около 20 °С, т. е. это были облигатные психрофилы [32].

8.1.2. Инкубация при низкой температуре

для получения культур

Listeria monocytogenes [39]

Клетки Listeria с трудом поддаются выделению из клинического материала, содержащего большое кодичество других бактерий (это материал из шейки матки, влагалища, мекония, фекалиев, носоглотки или тканей). Весьма полезной для получения накопительной культуры этой бактерии оказалась предлагаемая ниже процедура. Мазки помещают в пробирки с 5 мл бульона для листерий (разд. 8.2.25) и закрывают их завинчивающимися крышками. В случае проб из фекалий и тканей готовят 10%-ную (объем/объем) суспензию в бульоне для листерий. Бульон можно хранить при 4 °С до 3 мес. Поэтому целесообразно проводить выделение в первые 4 нед с недельными интервалами и затем делать месячный перерыв. При хранении на холоду бульон обогащается Listeria. Это обусловлено лучшим по сравнению с другими бактериями выживанием листерий при 4 °С [84]1, их способностью размножаться при 4°С [67] и выходом микроорганизма из клеток ткани [15]. После такого обогащения на холоду 0,2 мл суспензии переносят в пробирку с 5 мл бульона для листерий, содержащего KCNS (до стерилизации бульона к нему добавляют 3,75% тиоцианата калия), и инкубируют 48 ч при 25 °С. Для получения отдельных колоний петлю вводят непосредственно под поверхность среды и переносят ее на поверхность чашек с агаром Мак-Брайда для листерий (разд. 8.5.29).

8.1.3. Инкубация при высокой температуре

для получения культур термофилов [6]

В отличие от термофилов рост остальных микроорганизмов при высокой температуре подавляется. Поэтому для обогащения термофилами смешанную культуру инкубируют при достаточно высокой температуре. Например, в случае молочнокислых термофилов серийные разведения молока пересевают в чашки со стандартной агаровой средой (разд. 8.5.48) и инкубируют их при 55 °С.

8.1.4. Инкубация при высокой температуре

для получения культур Thermits aquaticus |11]

Т. aquaticus имеет оптимальную температуру роста 70—72 °С; эта бактерия не растет при температуре ниже 40 °С и выше 79 °С. Ее можно выделить из горячей

8. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

водопроводной воды, микробных матов, из горячих источников или рек, загрязненных горячими сточными водами. С этой целью исследуемые пробы добавляют к 10 мл основной солевой среды (разд. 8.5.7), содержащей 0,1% панкреатического гидролизата казеина и 0,1% дрожжевого экстракта. Инкубируют без встряхивания при 70—75 °С и следят за изменением мутности в течение 1—2 дней. Если мутность увеличивается, микробная масса обычно приобретает желтый или оранжевый цвет. Суспензию исследуют под микроскопом с целью обнаружения коротких и длинных нитей или сфе-ропластов. Чистую культуру выделяют путем посева на чашки с той же средой, содержащей 3% агара. На чашках ищут компактные разрастающиеся желтые колонии, состоящие из нитевидных микроорганизмов.

8.1.5. Нагревание для получения культур

термоустойчивых микроорганизмов [6]

Пробы сырого молока пастеризуют нагреванием до 62,8 °С и выдерживают их при этой температуре в течение 30 мин, затем их охлаждают, разводят, переносят на стандартную агаровую среду (разд. 8.5.48) и инкубируют чашки при 32°С.

8.1.6. Нагревание для получения культур

мезофильных спорообразующих бактерий

Пробы воды или взвеси почвы нагревают до 80 °С, выдерживают 10 мин и затем наносят штрихом на поверхность твердой среды в чашках. Для штаммов Bacillus обычно используют питательный агар; штаммы Clostridium рассевают по стенке вращающейся пробирки с восстановленным мясным агаром (разд. 20.3.10) или на поверхности свежеприготовленной агаровой среды и инкубируют в анаэростате.

Если в пробах есть небольшое количество спор, то их число можно увеличить, внеся пробы в подходящую для споруляции среду и инкубируя культуру в течение 2—21 дней перед тепловой обработкой. Для большинства видов Bacillus средой, на которой происходит образование спор, является питательный бульон (разд.

20.3.25), содержащий 0,5% дрожжевого экстракта, ?? •Ю-4 М СаС12, МО-3 М MgCl2 и 5-10~5 М MnCi2. Для большинства видов Clostridium не существует оптимальной среды для образования спор, однако известно, что их споруляцию можно вызвать инкубацией в мясной среде (разд. 20.3.10) как в присутствии глюкозы, так и в ее отсутствие [27].

Еще один способ получения накопительных культур заключается в добавлении проб, содержащих споры, к соответствующей среде, которую затем прогревают 10 мин при 80 °С и инкубируют около 1 сут. Выросшую культуру высевают на тв

страница 52
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.11.2017)