Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

шенной желатины. Со временем эти светофильтры подсыхают из-за проникновения воздуха с ребер, однако они выпускаются в широком ассортименте цветов и плоскостей и являются ценными принадлежностями микроскопа. Красный светофильтр (рэтен № 29) или оранжевый светофильтр (рэтен № 22) делают плотные структуры прозрачными, а структуры, окрашенными голубыми красителями, более контрастными. Зеленый светофильтр (рэтен № 58В) применяется чаще других в связи с тем, что именно к зеленому цвету наиболее чувствительна наша сетчатка, а также потому, что обычно используемые в гистологических исследованиях красители имеют красный цвет и при наблюдении через зеленый светофильтр контраст изображения сильно возрастает.

Зеркала с задней отражающей поверхностью (т. е. имеющие зеркальную поверхность за слоем стекла) хороши в повседневной работе и долговечны. Однако они не дают оптимального освещения, поскольку отражения источника света с передней поверхности стекла и с задней, где находится отражающий слой металла, не совпадают и перекрываются. То же происходит с изображением отверстия полевой диафрагмы, когда к окончательно получаемому изображению добавляется нежелательный рассеянный свет (методика Кёлера). Зеркала же с передней отражающей поверхностью не имеют защитного покрытия и дают лишь единственное отражение.

Самый важный элемент на пути света от лампы к объективу и к глазу — это конденсор, находящийся под предметным столиком. Апертуры объективов со значениями от 1,30 до 1,32 будут полностью эффективны только в том случае, если числовая апертура конденсора равна им по величине или больше. Такие конденсоры также обычно бывают ахроматическими или апланати-ческими, соответствуя в этом отношении описанным выше объективам. Здесь следует вспомнить о роли показателя преломления в выражении для числовой апертуры: разрешающая способность объективов с большой числовой апертурой реализуется только тогда, когда среда, через которую проходит свет после его поступления в конденсор и прохождения через объект и систему линз объектива, является однородной и стеклоподобной на всем пути. Иными словами, высокое разрешение получают тогда, когда иммерсионное масло находится между конденсором и предметным стеклом, а не только между покровным стеклом и линзой объектива.

Если в исследовательском микроскопе все налажено: окуляр, объективы, конденсор соответствующего качества, зеркало с передней отражающей поверхностью, на которое от яркого однородного источника поступает свет, прошедший через зеленый светофильтр, — он готов к работе. Чтобы проявились все его достоинства, необходима только хорошая подготовка препарата.

1.3.1. Освещение по Келеру

Для иммерсионного объектива освещение по Келеру (почти оптимальное освещение) достигается следующим образом:

1. Фокусирование изображения нити лампы осуществляют с помощью белого листка, помещаемого на зеркале под конденсором. При этом лампу располагают так, чтобы изображение нити (предпочтительно ленточной) целиком заполняло отверстие конденсора; это можно увидеть, убрав листок с зеркала.

2. Для визуальных наблюдений на пути света устанавливают соответствующие светофильтры. Полностью открывают все диафрагмы. Если используется лампа со спиральной нитью, то вблизи конденсора (разд. 1.1) помещают матовое стекло.

3. На конденсор наносят масло (одну каплю масла с высокой вязкостью) и поднимают его до соприкосновения с такой же каплей, нанесенной на предметное стекло (разд. 1.5).

4. При снятом окуляре приблизительно центрируют освещение глядя на заднюю линзу объектива с маленьким увеличением, в фокусе которого находится препарат. При этом регулируют положение зеркала и конденсора на максимальное центрирование и равномерное освещение. Пузырьки воздуха в масле и другие помехи общего характера легко выявляются в этих условиях и должны быть по возможности устранены (разд. 1.1).

5. Вставляют окуляр и просматривают препарат в целом, чтобы найти интересующие области.

6. На покровное стекло наносят масло (разд. 1.5), меняют объектив на иммерсионный и устанавливают фокус.

7. Делают отверстие диафрагмы лампы минимальным и фокусируют его край конденсором в плоскости препарата (при этом в фокусе находятся и объектив, и конденсор). Вновь регулируют отверстие диафрагмы лампы так, чтобы ее край совпадал с краем поля зрения.

Замечание. Если по краям диафрагмы лампы образуется неравномерная цветная бахрома, то конденсор требует центровки. Для этого поворотом двух его регулировочных ручек следует смещать конденсор в ту сторону, где бахрома окрашена в красный цвет, центрируя апертуру зеркалом по мере движения. Смещение прекращают, когда цвета бахромы распределятся симметрично.

8. Удалив окуляр (увеличение которого должно быть

не меньше 12Х или 15Х) и глядя вниз через тубус,

уменьшают апертурную диафрагму конденсора, чтобы

устранить блики и отражения. Уменьшение не должно

составлять больше Vio диаметра задней линзы объектива; чрезмерное уменьшение снижает разрешающую способность.

9. Вставляют окуляр и устанавливают соответствующие светофильтры для визуальных наблюдений или фотографирования.

10. Те же принципы применяются и к безыммерсионным объективам, но в этом случае нет необходимости

наносить иммерсионное масло на конденсор, если качество последнего удовлетворительное.

1.4. ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

В люминесцентном микроскопе к оптике предъявляются те же требования, которые были описаны выше в случае обычного исследовательского микроскопа. Различия в эксплуатации и конструкции относятся к генерированию и передаче света с длинами волн, пригодными для возбуждения флуоресцирующих красителей (флуо-рохромов) или естественной флуоресцендии в объекте, а также к детектированию света для тех длин волн, которые возникли в объекте в результате флуоресценции. Поскольку для возбуждения нужны, как правило, малые длины волн в области, близкой к ультрафиолетовой, лампа (обычно ртутная дуговая лампа высокого давления), линзы конденсора и любые другие линзы на пути от лампы к объекту должны быть изготовлены из материала (обычно флюорит), хорошо пропускающего свет таких длин волн. Существенным моментом является использование зеркала с передней отражающей поверхностью (без стеклянного слоя). Иммерсионное масло для объектива и конденсора не должно флуоресцировать (например, специальное синтетическое масло или масло сандалового дерева).

Самое главное для микроскописта — правильно расположить светофильтры на пути света. В приборах разных фирм-изготовителей светофильтры расположены по-разному, однако для них существуют следующие общие принципы:

1. Между объективом и окуляром должен находиться запирающий светофильтр, отсекающий ультрафиолет. Этот светофильтр защищает глаза от вредного воздействия ультрафиолета.

2. Между лампой и объектом должны располагаться возбуждающие и задерживающий светофильтры. Возбуждающие светофильтры представляют собой интерференционные фильтры с узкой областью пропускания (например, 365 нм), соответствующей используемому флуо-рохрому. Они непрозрачны для большей части видимого света, и поэтому фон, видимый глазом при просмотре препарата, получается черным или темно-синим. Задерживающий светофильтр отсекает ультрафиолет, но пропускает видимый свет, что необходимо для выбора поля зрения и предварительной фокусировки при обычном освещении.

Системы освещения могут быть разных типов: 1) с передачей света через конденсор, находящийся под предметным столиком, 2) темнопольное освещение с использованием специального конденсора и 3) верхнее освещение через объектив. Системы второго и третьего типа обладают преимуществами эффективной темнопольной системы, поскольку возбуждающий пучок не дает избыточного постороннего света для глаза и не мешает выявлению более слабого флуоресцентного света от образца. В системе третьего типа конденсором служит объектив, вследствие чего отпадает проблема центрирования. Одновременно при этом сводятся к минимуму потери слабого излучения флуоресценции, обусловленные поглощением в толще образца. Возбуждающий пучок отражается вниз по направлению к объективу с помощью светоделительного зеркала, которое находится в боковом окне тубуса микроскопа. Это зеркало отражает свет с возбуждающими длинами волн, но пропускает видимый свет, функционируя, таким образом, в качестве барьерного светофильтра.

Клетки или другой исследуемый материал реагируют с флуорохромами (например, с ксантиновыми, акридиновыми, хинолиновыми производными и т. д.) как с красителями, а также с веществами, которые высвобождают флуорохромы (например, флуоресцеин). Это позволяет проводить локализацию и распознавание антигена. О том, как обращаться с микроскопом и светофильтрами, а также о необходимых предосторожностях лучше всего узнать у человека, имеющего опыт работы с микроскопом, или прочитать в руководствах, выпускаемых изготовителями. Получаемые результаты можно фиксировать на пленке, цветной или черно-белой.

В связи с тем, что: 1) выход флуоресценции мал (меньше 1 : 100), 2) флуоресцирующая часть образца незначительна (в большинстве случаев) и 3) для большинства флуорохромов характерна тенденция флуоресценции к затуханию со временем, интенсивность флуоресценции, как правило, низка и поэтому мы рекомендуем следующее:

1. Работать в темноте или в хорошо зашторенной комнате.

2. Не применять линз и светофильтров, в которых нет необходимости (не нужно и матовое стекло у осветителя), и укорачивать световые пути настолько, насколько позволяет система.

3. В случае вспомогательных линз проверять, в каком положении они дают наибольшее количество света. Полностью открывать конденсорную (апертурную) диафрагму.

4. Использовать окуляры малого увеличения (8Х), поскольку интенсивность воспринимаемого флуоресцентного света находится в обратной экспоненциальной зависимости от общего увеличения.

5. Для фотографирования использовать высокочувствительные пленки.

6. Если имеется возможность, пользоваться верхним, а не нижним освещением.

1.5. ИММЕРСИОННЫЕ МАСЛА

Иммерсионные масла предназначены для

страница 5
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.09.2017)