2НР04 MgS04-7H20 FeS04-7H20 MnS04-4H20 NaCl

Пуриновые и пиримидиновые основания: Аденинсульфат • Н20 Гуанин-НСЬН20 Урацил Ксантин

Витамины: Тиамин -НС1 Пиридоксин-HCl Пиридоксамин ? НС1 Пиридоксаль - НС1

50 г 40 г 6 г

1,2 г 1,2 г 400 мг 20 мг 40 мг 20 мг

20 мг 20 мг 20 мг 20 мг

1 мг

2 мг 0,6 мг 0,6 мг

Компонент Количество на I л среды с двойной концентрацией

DL-Пантотенат кальция 1 мг

Рибофлавин 1 мг

Никотиновая кислота 2 мг

я-Аминобензойиая кислота 0,2 мг

Биотин 0,002 мг

Фолиевая кислота 0,02 мг

Дистиллированная вода До 1000 мл

изомеры. Если, например, L-изомер отсутствует, а есть DL-изомер, то последнего берут в 2 раза больше.

Минеральные соли. Солевой раствор А получают следующим образом: 25 г КН2Р04 и 25 г К2НРО4 растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 250 мл. Остальные соли объединяют в следующих количествах: 10 г MgS04-7H20, 0,5 г FeS04-7H20, 0,8 г MnS04*4H20 и 0,5 г NaCl. Смесь растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 250 мл и добавляют 1 каплю концентрированной HCI, чтобы предотвратить образование осадка (солевой раствор В). Оба раствора устойчивы при комнатной температуре, но лучше хранить их в холодильнике, чтобы предупредить рост плесени в растворе А и окисление Fe2+ в растворе В.

Пуриновые и пиримидиновые основания. Ксантин и гуанин растворяют при нагревании в разбавленной НС1; аденин и урацил растворяют в теплой воде. Смешивают эти растворы и добавляют к ним столько воды, чтобы концентрация каждого основания в смеси была 1 мг/мл. Раствор устойчив при хранении в холодильнике.

Витамины. Смешивают все витамины, за исключением биотина и фолиевой кислоты, причем количество каждого из них должно быть в 10 раз больше, чем указано в табл. 7.14. Исходные растворы биотина и фолиевой кислоты каждый с концентрацией 1 мг/мл готовят отдельно. Биотин солюбилизируется при нагревании; для лучшего растворения фолиевой кислоты добавляют небольшое количество NH4OH. После того как в смесь витаминов внесли 0,02 мл раствора биотина и 0,2 мл раствора фолиевой кислоты, объем доводят дистиллированной водой до 60 мл и смесь нагревают до растворения всех компонентов. Хранят этот раствор при 5 °С и меняют каждые две недели.

Глюкоза, ацетат натрия и хлористый аммоний. Сначала делают навески глюкозы, ацетата натрия и хлористого аммония. Для приготовления 500 мл основной среды с двойной концентрацией взвешивают 3,1 г смеси аминокислот (не учитывая вес исключенных из нее аминокислот) и растворяют ее нагреванием примерно в 400 мл воды. Добавляют последовательно 25 г глюкозы, 20 г ацетата натрия, 3 г NH4CI, 6 мл солевого раствора А, 5 мл солевого раствора В, 10 мл основного раствора пуриновых и пиримидичовых оснований и 3 мл раствора витаминов. Объем доводят дистиллированной водой до 500 мл, а рН среды устанавливают 6,8, (Описанная и сходные с ней среды продаются, например фирмой Difco Laboratories )

Приготовление образцов

Для получения правильных результатов в анализируемых пробах необходимо, чтобы факторы роста в них были в той же химической форме, что и вещество, используемое в качестве стандарта. Так, белки следует тщательно высушить перед взвешиванием и полностью гидролизовать (Многие пептиды могут поступать в клетки и гидролизоваться, поставляя тем самым лимитирующие аминокислоты; однако количественный ответ на входящую в состав пептида аминокислоту может не соответствовать ответу на свободную аминокислоту.) Можно пользоваться любой методикой для полного гидролиза, гарантирующей незначительное разрушение аминокислот.

Для определения аргинина образцы белка высушивают нагреванием в течение 3 ч при температуре 60 °С под давлением 20 мм рт. ст. (2,7 кПа). Тщательно взвешивают около 200 мг образца, помещают его в пробирку из пирексового стекла размером 25X200 мм, добавляют 10 мл 4 н. НС1. Пробирку закрывают и автоклавируют 8 ч под давлением 103 421 Па. После охлаждения пробирку открывают, нейтрализуют ее содержимое (рН 6,8) и доводят его до нужного объема. Некоторые аминокислоты (частично триптофан и тирозин и в меньшей степени некоторые другие аминокислоты) разрушаются при кислотном гидролизе. В этом случае следует использовать другие методы.

Аминокислоты, которые используются в качестве стандартов (в данном случае аргинин), также высушивают в течение 2 ч при 60 °С при давлении 20 мм рт. ст., тщательно взвешивают и растворяют в воде.

Методика определения

Инокулят готовят следующим образом. В пробирки вносят полную среду С с двойной концентрацией (табл. 7.14), содержащую 0,2% дрожжевого экстракта, разбавляют равным объемом дистиллированной воды, отбирают аликвоты объемом по 10 мл в культуральные пробирки, закрывают пробками и стерилизуют автоклавироваиием. Некоторые пробирки с инокулятом можно приготовить заранее и хранить при 5°С. За день до определения с помощью инокулирующей иглы переносят часть бактерий с соблюдением правил асептики с агарового косячка в другую пробирку со средой и инкубируют ее при 37 °С в течение 15—18 ч. Непосредственно перед экспериментом клетки собирают центрифугированием. Надосадочную жидкость декантируют, а клетки суспендируют в 10 мл стерильной воды. Вновь центрифугируют и суспендируют клеточный осадок в. 10 мл стерильной воды, получая таким образом отмытую суспензию бактерий для последующей инокуляции.

Определение проводят в пробирках размером 18Х Х150 мм без бортиков, помещенных в металлический штатив. Если о росте судят по образованию кислот, то, как рекомендуют Стил и др. [216], общий объем среды должен быть не менее 2 и не более 10 мл. Для турби-диметрических измерений общий объем должен составлять 10 мл, что и выполняется в описываемом ниже эксперименте.

Стандартную кривую получают путем разведения 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 160 и 200 мкг L-аргинина • НС1 в 10 мл общего объема. В пробирки вносят пробы в количествах, соответствующих концентрациям аргинина от 10 до 100 мкг на 10 мл. Дистиллированной водой доводят объем в каждой пробирке до 5 мл и затем добавляют по 5 мл среды с двойной концентрацией. Пробирки закрывают, стерилизуют авгоклавированием в течение 10 мин под давлением 103 421 Па, охлаждают и ино-кулируют отмытой клеточной суспензией, полученной, как описано выше. Количество инокулята не является важным фактором при определении аминокислот, если в каждой пробирке оно одно и то же (достаточно одной капли).

При турбидиметрических измерениях роста бактерий пробирки с культурой инкубируют в течение 20 ч при 37°С. За ростом клеток следя! фотометрически при длине волны >600 нм, где снижена до минимума интерференция, вызываемая окраской среды (можно использовать, например, колориметр Bausch and Lomb, модель 20). При использовании образцов объемом 2 мл время инкубации удлиняется до 72 ч, а рост культуры измеряют с помощью титрования образуемой кислоты 0,2 н. NaOH.

Строят стандартную кривую для аргинина на графике, по одной оси которого откладывают интенсивность роста (плотность клеток после 20 ч роста) или данные титрования, а по другой — количество добавленного стандартного раствора аргинина. Для каждого результата, полученного с известным количеством образца, по стандартной кривой находят то количество аргинина, которое вызывает соответствующую стимуляцию роста. Используют начальную (восходящую) часть кривой, где наблюдается линейная зависимость между интенсивностью роста бактерий и концентрацией аргинина. В этот отрезок кривой должно уложиться несколько точек из разных разведений исследуемой пробы, причем расхождения должны быть незначительными. Полученные результаты выражают в миллиграммах аргинина на 1 г пробы или в других удобных величинах.

7.3.2. Витамины

Витамины определяют методами, сходными с методами, используемыми для аминокислот. Вместо смеси аминокислот в ростовую среду можно вносить лишенный витаминов гидролизат казеина с добавками аминокислот, которые были разрушены при кислотном гидролизе или присутствуют в казеине в субоптимальных концентрациях. Обычно витамины нужны в значительно более низких концентрациях, чем аминокислоты. Так, для типичной тест-бактерии Lactobacillus plantarит оптимальная потребность в биотине составляет 1 нг/10 мл культуры. В связи с этим необходимо всегда работать с очень тщательно вымытой стеклянной посудой, особенно пробирками. Для мытья посуды нельзя использовать растворы кислоты, содержащие хроматы, поскольку несмываемые с помощью многократного споласкивания хроматы даже в минимальных (следовых) количествах подавляют рост бактерий. Вполне пригодна следующая обработка: культуральпые пробирки заполняют дистиллированной водой, автоклавнруют 10 мин, воду сливают и пробирки высушивают. Поскольку пробки также могут служить источником химического загрязнения, их следует перед каждым опытом промывать.

Так как витамины весьма различаются между собою по устойчивости и по химическому строению, не существует универсальной процедуры высвобождения связанных витаминов. Как правило, широко используют следующие способы обработки проб [204]: 1) гидролиз разбавленной кислотой, нейтрализация, доведение водой до нужного объема и фильтрование или 2) обработка смесью ферментов, автоклавирование для остановки действия ферментов, доведение до нужного объема и фильтрование.

7.4. ЛИТЕРАТУРА

1. Aaronson S. J. Bacteriol., 69, 67—69 (1955).

2. Allison M. J., Bryant M. P., Doetsch R. N. Science, 128, 474—475 (1958).

3. Allison M. J., Bryant M. P., Doetsch R. N. J. Bacteriol., 83, 523— 532 (1962).

4. American Type Culture Collection. Catologue of strains I, 13th ed., American Type Culture Collection, Rockville, Md., 1978.

5. Аристовская Т. В. ДАН СССР, 136, 954—957 (1961).

6. Baird-Parker А. С. Nature (London), 180, 1056—1057 (1957).

7. Baird-Parker А. С. J. Gen. Microbiol., 22, 458—469 (1960).

8. Baldacci E.t Locci R. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey's manual of determinative bacteriology, 8th ed., p. 829— 831, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

9. Baron L. S., Carey W. F., Spilman W. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 45, 976—984 (1959).

1