Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

ков воздуха в масле (пузырьки легко выявляются, если снять окуляр и посмотреть вниз через тубус). В этом случае поднимают объектив или поворачивают револьвер, чтобы вытереть с объектива масло (обычно пузырьки переходят на объектив) и вновь фокусируют изображение. Причиной плохого изображения может также служить случайно закрытая диафрагма, сдвинутая лампа или зеркало. Устранение других возможных неполадок см. в разд. 1.7.

Помните и выполняйте следующие простые правила работы с микроскопом.

Правило 1. Сфокусированное изображение должно быть хорошо освещено.

Правило 2. Если света слишком много, применяют нейтральный светофильтр или отодвигают подальше источник света. Для иммерсионных объективов, имеющих большую апертуру, важно избежать уменьшения освещаемой области опусканием конденсора или прикрыванием апертурной диафрагмы конденсора более чем на 10%, хотя это может оказаться полезным при использовании безыммерсионных объективов с маленькой апертурой и при просматривании живых неокрашенных клеток.

Правило 3. Если для объектива, который хотят использовать, света не хватает, то причина кроется либо в том, что свет чем-то заслонен, либо в том, что не подходит данная система освещения. В последнем случае следует заменить лампу или конденсор.

Правило 4. Исследуемый препарат должен быть частью (почти) однородной оптической системы и залит маслом, водой или соответствующей средой. Никаких деталей нельзя различить в высушенных окрашенных пленках бактерий, рассматриваемых с помощью безыммерсионного объектива.

Правило 5. Линзы должны быть всегда чистыми и не-запыленными, без следов пальцев, носа и туши с накрашенных ресниц.

Отдельные живые бактерии, дрожжевые клетки или грибные гифы хорошо видны даже при просмотре через дно чашки Петри с объективом 10Х. При этом природа и состояние исследуемого материала устанавливаются без каких-либо дополнительных манипуляций. Здесь стоит сделать два следующих замечания, существенных при работе с чашками Петри: 1) лучшее освещение при обследовании чашки через дно обеспечивается использованием вогнутого зеркала и 2) искажение изображения за счет царапин на стекле или неровностей дна чашки в области, находящейся под микроскопом, можно устранить с помощью капли иммерсионного масла; каплю накрывают покровным стеклом, благодаря чему обеспечивается однородный световой путь и скрываются дефекты поверхности.

1.2. ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Микроскоп, который собран и постоянно используется для фазово-контрастной микроскопии, следует предпочесть тому, который работает и как фазово-контрастный и как обычный (после соответствующей замены оптики) на том же штативе. Для фазово-контрастной микроскопии требуется много света и гораздо большая оснащенность по сравнению с обычной микроскопией окрашенных препаратов. Для уменьшения неизбежных хроматических аберраций пользуются зеленым светофильтром.

Существенным является центрирование фазовой пластинки, находящейся в конденсоре, по отношению к пластинке в задней фокальной плоскости объектива. Центрирование достигается проецированием их обеих при помощи фокусирующего окуляра («телескопа»), и приведением к центру создаваемой ими системы колец, для чего пользуются двумя регулировочными ручками по бокам конденсора.

Одно из преимуществ фазово-контрастной микроскопии перед темнопольной, которая применяется в настоящее время реже, заключается в полном использовании апертуры объектива, что влечет за собой необходимость применения самых высококачественных фазово-конт-растных объективов. Это в свою очередь предполагает использование конденсора с достаточно большой апертурой и, так же как и раньше, применение компенсационных окуляров с увеличением 15х или даже 20X, способных реализовать то высокое разрешение, которое дают объективы. Вполне доступны фазово-контрастные иммерсионные объективы средней силы (40Х—60Х), которые дают хорошо очерченные полноценные изображения при работе с мицелием грибов и другими большими клетками. Наилучшие результаты получают, применяя объективы с увеличением 90Х и 100Х и числовой апертурой больше 1,0, используя иммерсию. Однако удовлетворительные результаты фазово-контрастная микроскопия дает и без применения иммерсии, например при подсчете бактерий, простейших и спор, проверке подвижности или при определении размера и формы. В том случае, когда хотят увидеть детальную внутриклеточную организацию живых организмов, следует обратить внимание на преломляющие свойства среды, в которой рассматриваются клетки; наилучших результатов достигают при добавлении в среду желатины до 15—30%. При этом показатели преломления среды и внутриклеточного содержимого становятся одинаковыми или почти одинаковыми, а фазовая задержка пропорциональна показателю преломления, умноженному на световой путь. В этих условиях уменьшаются также ореолы.

1.3. МИКРОСКОПИЯ С ВЫСОКИМ РАЗРЕШЕНИЕМ

Под «исследовательским микроскопом» имеют в виду микроскоп, позволяющий выявлять тонкую детальную структуру при большом увеличении. Он не предназначен для оценки результатов окраски по Граму, зато он помогает разрешать вопросы, которые касаются жгутиков и другого материала, требующего выявления тонких деталей. В этих целях самое пристальное внимание следует уделить качеству оптики. Чтобы достичь высокого разрешения, а также устранить хроматические и сферические аберрации, нужно с вниманием отнестись к основополагающим принципам.

Разрешение (R) есть наименьшее расстояние между точками детали в препарате, которые еще не сливаются в изображении, видимом в микроскоп или на фотографии. R=^/2-(ч. а,), где К — длина волны применяемого света, а ч. а. — числовая апертура — мера светособираю-щей способности объектива. Для получения наименьших значений R следует применять коротковолновый свет, хотя, к сожалению, свет наиболее эффективной части спектра (а именно ультрафиолет в области 365 нм) не воспринимается глазом и не проходит через стекло. Чтобы использовать преимущества ультрафиолетового света, например в случае люминесцентной микроскопии, нужна оптика из кварца или плавикового шпата (флюорита) и необходимы непрямые методы наблюдения. Наилучшие результаты с видимым светом получают в желто-зеленой области спектра, поскольку аберрации объективов минимизируются именно для этой области длин волн. С точки зрения разрешения эта область, однако, является сравнительно длинноволновой.

Числовая апертура иммерсионного объектива обычно составляет 1,30 или 1,32, у наилучших объективов она достигает 1,4. Она представляет собой произведение синуса половины угла между крайними лучами пучка света, входящего в объектив, на показатель преломления среды, через которую свет проходит к объективу. Максимальное значение, которое может принимать функция синуса, не превышает 1,0, но показатель преломления среды, через которую свет проходит к объективу, можно

i. СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ

увеличить до значения показателя преломления оптического стекла (т. е. до 1,5150) применением иммерсионного масла. Именно это позволяет нам поднять числовую апертуру до значений выше 1,0 и, создав определенные условия, полностью использовать разрешающую силу дорогостоящих объективов со значениями апертур 1,30 или 1,32, выбитыми на их сверкающих оправах. Ахроматические и апохроматические объективы с большой числовой апертурой исправлены на сферическую аберрацию и на хроматическую аберрацию для двух или трех цветов в центре поля зрения (где в основном проводится работа при большом увеличении). Объективы обоих типов работают почти одинаково хорошо, оправдывая свою цену, особенно когда применяются узкополосные (интерференционные) светофильтры.

Объективы, наиболее подходящие для выполнения поставленной задачи, важно дополнить окулярами соответствующего качества. Для этого нужны компенсационные окуляры, названные так потому, что «они рассчитаны на исправление боковой хроматической ошибки, возникающей при увеличении в линзах объективов с большой апертурой и хорошей коррекцией аберраций» [3]. Имеющийся опыт подтверждает правильность совета Шилабера [9], согласно которому «компенсационные окуляры должны иметь большую силу, желательно 15х или 20X. Возможности применения апохроматических объективов в сочетании с высокоразрешающими окулярами должны использоваться полностью; в противном случае тонкие детали, которые с их помощью могут быть выявлены на микрофотографиях, останутся невыясненными». Для тех, кто носит очки с сильными линзами, удобно и полезно приобрести специальные окуляры, с которыми можно работать в очках.

Оптимальная работа высокоразрешающих объективов зависит от оптимального освещения. Поле зрения должно быть освещено равномерно, яркости должно хватать для фотографирования. Свет от спиральных нитей ламп распределяется по их поверхности и, следовательно, по их изображению неравномерно, если он не рассеивается специальным матовым стеклом. Самыми лучшими бесструктурными источниками света стандартной яркости являются небольшие ртутные или циркониевые дуговые лампы и менее дорогие удобные проекционные лампы с вольфрамовой бусинкой или ленточной нитью, изображение которых может целиком заполнить конденсор. Для широко применяемой системы освещения по Кёлеру (разд. 1.3.1) требуется оснастить лампу микроскопа двумя дополнительными устройствами: системой линз, способной проецировать резкое изображение источника света на входную плоскость конденсора, и находящейся перед этими линзами ирисовой полевой диафрагмой (см. ниже методику Кёлера). Нейтральные светофильтры (оптические пластины с алюминиевым покрытием) позволяют регулировать яркость до удобного для глаза уровня, а цветные светофильтры сужают спектр используемых для освещения длин волн. Имеются два вида цветных светофильтров: дорогие интерференционные светофильтры, пропускающие узкую область спектра и состоящие из двух полупосеребренных пластин со строго определенным зазором между ними, и рэтен-фильтры (Kodak), состоящие из двух квадратных стеклянных пластин (сторона квадрата 5 см) с полировкой оптического качества, между которыми заключен слой окра

страница 4
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.04.2017)