Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

. Как это делают на практике, мы рассмотрим в данном и следующем разделах книги на двух примерах.

Для выделения и сохранения чистых культур строгих анаэробов Хангейт [25] предложил метод вращающихся пробирок. Вскоре появилось много модификаций его метода. Основным преимуществом этого метода является то, что для работы требуется минимум специальной аппаратуры, а для культивирования специфических групп, например метанобразующих бактерий [17], может быть создана любая атмосфера. Подробное описание различных модификаций метода можно найти в ряде статей [6, 17, 28, 29]. В книге «АпаегоЬе laboratory manual» [15], опубликованной Виргинским политехническим институтом совместно с Университетом штата Виргиния, приведены модификации методов ускоренной работы с большим числом анаэробных культур. Практически все препараты и оборудование, необходимое для работы с анаэробной системой модели V. P. I., поставляет фирма Bellco Glass, Inc., Vineland, N. J.

Несмотря на очень подробное описание некоторых модификаций метода Хангейта, им довольно трудно овладеть. Лучше всего посетить для этого лабораторию, где этот метод применяется. Ниже приводятся только основные этапы и наиболее простые приемы, используемые в методе Хангейта.

Удаление кислорода из газов

Из газов, используемых для замещения воздуха, следует удалить кислород с помощью одного из следующих приемов.

1. Пропускают газ через колонку или сушильную печь, нагретую до 350 °С и содержащую медь [6]. Медь чернеет после ее полного окисления. Для регенерации меди в восстановленную форму ее выдерживают в атмосфере, содержащей не менее 3% Н2. (Предупреждение: пока в колонке остается примесь 02, не пользуйтесь чистым Н2, так как не исключена опасность взрыва.)

2. Газ с 3%-ным содержанием Н2 пропускают через очиститель модели Deoxo (Matheson Scientific, Inc., Rutherford, N. J.).

3. Газ пропускают через специальную склянку с раствором титана (III)-цитрата (см. табл. 6.6). Когда раствор полностью окисляется, т. е. становится бесцветным, его заменяют.

Приготовление предварительно восстановленных сред

В круглодонную колбу помещают устойчивые к нагреванию компоненты среды (за исключением восстанавливающего агента), добавляют предварительно про-стерилизованные кипячением кусочки стекла и осторожно кипятят раствор, пропуская над его поверхностью струю газа, лишенного кислорода. Газ продолжают пропускать и во время остывания среды, и при ее разливе. В зависимости от вида среды и культивируемого анаэроба используют двуокись углерода или аргон с добавленным к ним Н§ (3%). Применяют газовый зонд, показанный на рис. 6.2. Когда среду необходимо использовать вскоре после автоклавирования, к ней сразу же добавляют восстанавливающий агент, если он устойчив к нагреванию. Если же восстанавливающий агент не обладает этим качеством, то его вносят в среду непосредственно перед инокуляцией. Среду разливают по пробиркам или флаконам, снабженным пробками из черной резины (лучше всего бутиловой), соблюдая следующие предосторожности.

1. Во время разлива среды над ее поверхностью постоянно пропускают струю бескислородного газа, причем пробирки или флаконы, в которые разливают среду, также следует предварительно продувать газом.

2. Предварительно заполняют газом пипетку, используемую для внесения среды. Эту пипетку оснащают грушей или резиновой выходной трубкой. Не следует набирать газ или жидкость в пипетку быстрее, чем газ поступает в сосуд.

3. После разлива среды пробирку или флакон закрывают пробкой таким образом, чтобы в них не попал воздух. Эта крайне важная операция требует определенного навыка. Для этого пробку держат у входного отверстия пробирки, продолжая пропускать газ еще в течение нескольких секунд, а затем быстро вынимают из пробирки газовый зонд и одновременно закрывают пробкой, фиксируя ее вращательными движениями.

Согласно другому способу, флакон со средой, лишенной кислорода, можно закрыть пробкой из бутиловой резины, как описано выше. Пробку закрепляют зажимом или проволокой, затем среду автоклавируют [21] и разливают по пробиркам с соблюдением правил асептики. Однако при использовании этого способа увеличивается опасность загрязнения стерильной среды и не исключается попадание в нее следов кислорода.

Для стерилизации пробки в пробирках или флаконах должны быть закреплены с помощью зажимов. Существует специальный пресс для удерживания в фиксированном положении целого набора культуральных пробирок с пробками, поставляемый фирмой Be'llco Glass, Inc. Зажимы для отдельных пробирок можно изготовить самим из вешалки для одежды '[17]. В специальных пробирках Хангейта, снабженных завинчивающимися крышками с отверстием диаметром 9 мм (Bellco Glass, Inc., № 2047), резиновые пробки с бортиками не нуждаются в зажимах. Используют также пробирки или сосуды с горлышком, как у флаконов для сывороток, оснащенные перегородчатыми пробками из бутиловой резины [29]. Пробки можно закреплять с помощью алюминиевых крышек (Wheaton Scientific, Millville, N. J.).

Инокуляция и пересев

При использовании пробирок Хангейта [6] или пробирок и бутылей с горлышком, как у флаконов для сывороток [29], инокуляцию культуры и ее пересев можно производить с помощью обычных шприцов для подкожных инъекций. Предварительно через шприц несколько раз пропускают газ, не содержащий кислорода. Среды в пробирках, оснащенных хорошо подогнанными резиновыми пробками, инокулируют следующим образом: быстрым движением немного вынимают пробку и в образовавшееся отверстие вставляют стерильную газовую канюлю, добавляют инокулят, вынимают канюлю и затем пробирку вновь закрывают пробкой. Образцы или культура, из которой отбирают инокулят, должны также обдуваться струей газа и находиться рядом с пробиркой, в которую переносят инокулят. Серологическую или пастеровскую пипетку, используемую для пересева, предварительно заполняют стерильным газом. Пересев производят также с помощью стальной или платиновой петли. Для быстрой инокуляции различных сред одной культурой очень удобна система для выращивания анаэробных культур V. P. I. (Bellco Glass, Inc.).

Вращающиеся пробирки

Для выделения отдельных колоний строгих анаэробов и для подсчета жизнеспособных клеток используют вращающиеся пробирки, которые удобнее, чем чашки Петри. Готовят агаровую среду, как описано выше, и разливают ее по пробиркам. Охлаждают расплавленный агар до 45 °С в пробирках с пробками и зажимами. Если пробирки со средой приготовлены заранее, перед кипячением необходимо убедиться в том, что они снабжены зажимами. Неразведенные пробы и пробы, разведенные предварительно восстановленной средой (или раствором), переносят в пробирки, как описано выше, смешивают со средой (при этом следят за тем, чтобы не образовалась пена) и затем вращают пробирку под струей холодной воды, пока агар не застынет. Стараются, чтобы агар равномерно покрыл стенки пробирки. Механическое устройство, облегчающее эту процедуру [5], поставляется фирмой Bellco Glass, Inc.

Вращающиеся пробирки можно засевать штрихом с помощью специальной петли или шпателя, начиная со дна пробирки и затем постепенно продвигая петлю вверх, одновременно вращая пробирку и продувая ее газом с помощью газовой канюли (разд. 8.4.1), Фирма Bellco Glass, Inc. производит устройство для вращения пробирок во время посева культуры штрихом.

6.6.5. Анаэробные камеры для строгих анаэробов

(анаэростаты)

Аранка и др. [19] и Аранка и Фритер [18] описали изготовленную из гибкой пластмассы камеру, оснащенную специальным устройством с перчатками, в которой выращивают анаэробные бактерии столь же эффективно, как и во вращающихся пробирках. Эта камера, известная как «анаэробная камера Фритера», была испытана и используется во многих лабораториях. Она пригодна для работы даже с очень чувствительными мета-нобразующими бактериями [20]. Ряд подобных камер поставляется различными фирмами (например, Coy Laboratory Products, Inc., Ann Arbor, Mich.).

Среди главных преимуществ таких камер следует отметить то, что они позволяют использовать стандартные бактериологические методы, включая посев культуры в чашках, перенос колоний с помощью реплик и определение чувствительности к антибиотикам. Кроме того, они позволяют приготовить любую необходимую среду, а для работы с ними не требуется особого навыка. Однако для этих дорогостоящих камер нужно специальное помещение; кроме того, возникает ряд неудобств при работе в перчатках и с предварительно приготовленными средами.

Совместное использование метода Хангейта и хорошо функционирующей анаэробной камеры позволяет проводить практически все виды экспериментов с большинством строгих анаэробов. Ниже мы остановимся на условиях работы с анаэробными камерами и укажем на основные предосторожности, о которых необходимо помнить.

1. Существуют камеры, которые можно использовать так же, как термостаты. При температуре в камере от 30 до 37 °С руки нагреваются и потеют, и бывает трудно снять с них перчатки. Поэтому при работе в камере даже при комнатной температуре в течение долгого времени лучше надеть вначале нейлоновые перчатки, а сверху резиновые. Во многих случаях предпочтительнее иметь небольшой термостат внутри камеры. Можно также чашки Петри с засеянной средой или другие емкости поместить в специальные сосуды, закрыть их и удалить из камеры для последующей инкубации.

2. Используемая в камере газовая смесь должна содержать 10% водорода. Наиболее часто используемые смеси содержат азот с 5% С02—10% Н2 или азот с 10% Н2. Если в процессе работы с бактериями необходим С02, то следует обеспечить его бесперебойную подачу. Газовые смеси поставляются фирмой Matheson Scientific, но они довольно дороги. Эта же фирма производит газосмеситель, который очень полезен в работе.

3. Запрещается работать в камере с открытым пламенем. Лучше установить в ней электрический нагреватель, например типа Bacticinerator фирмы Scientific Products.

4. Рекомендуется установить в камере фильтр для газовых смесей типа фильтра, используемого для безмикробных камер (Standard Safety Equipment Co., Palatine, 111.)

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.11.2017)