Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

мотическим давлением, проницаемостью и транспортными системами бактерий обсуждается в гл. 19.

6.3. ТЕМПЕРАТУРА

Температура инкубации значительно влияет на интенсивность роста бактерий, поскольку она воздействует на скорость всех клеточных реакций. Кроме того, температура может влиять на характер метаболизма клеток, их потребности в питательных веществах и состав.

У большинства бактерий зависимость скорости роста от температуры сходна с зависимостью, представленной на рис. 6.1, А Полезная область температуры, близкая к оптимальной, обычно довольно узка, а максимальная температура роста нередко лишь на несколько градусов (от 3 до 5°С) выше оптимальной. Вместе с тем минимальная температура роста может быть на 20— 40°С ниже оптимальной. Чтобы рост бактерий был заметен при минимальной температуре, их следует инкубировать довольно долго. Например, по данным Ингрэ-ма [26], чтобы добиться удвоения клеток Е. coll при температуре 8°С, эти бактерии необходимо выращивать 41 ч, а при оптимальной температуре для этого достаточно 21 мин.

Ниже оптимума изменения скорости роста бактерий сравнимы с температурной зависимостью химических реакций только в небольшом интервале температур. Так, если мы отложим на графике (рис. 6.1,5) логарифм скорости роста против обратных величин абсолют

ной температуры (зависимость Аррениуса), то линейная зависимость наблюдается лишь в ограниченном интервале температур [10, 26, 31]. У большинства бактерий температурный коэффициент Qio скорости роста в этом интервале близок к 2; иными словами, при увеличении температуры на 10 °С скорость роста удваивается. В границах оптимальной температуры роста кривая Аррениуса для скорости роста почти горизонтальна, но при температурах, близких к максимальной и минимальной, она приобретает почти вертикальный наклон.

В целом при температурах роста несколько выше максимальных бактерии не только замедляют свой рост, но и быстро гибнут. Поэтому инкубация бактериальной культуры при температурах выше оптимальной требует точного температурного контроля. Для большей безопасности культуру лучше инкубировать ниже ее температурного оптимума, в пределах колебаний заданной температуры термостата.

В обычных воздушных термостатах конвекционного типа колебания температуры достигают нескольких градусов Цельсия и даже больше при частом открывании дверцы. Даже у термостатов с водяной рубашкой и, следовательно, с более постоянной температурой колебания

т

в 1 °С не столь уж редки. Для точного температурного контроля пользуются перемешиванием воды в банях; в этом случае температурные колебания составляют сотые доли градуса. Для точного измерения влияния температуры на скорость роста бактерий необходима инкубация в таких банях.

При осуществлении температурного контроля на практике придерживаются следующих правил.

1. Во время инкубации измеряют температуру в различных частях термостата термометрами, помещенными в колбы или пробирки с водой.

2. Поскольку температура и влажность воздушных термостатов значительно варьируют, для усиления воздушных конвекционных токов пользуются феном. Культуру в термостате располагают таким образом, чтобы она ни в коем случае не попала в «мертвое» воздушное пространство. Термостат открывают только в случае крайней необходимости.

3. В ответственных экспериментах при изучении температурной зависимости следят за охлаждением поверхности среды при ее испарении и поэтому там, где это возможно, пользуются посудой с хорошо пригнанными пробками. Если необходима постоянная циркуляция воздуха, например для аэробных бактерий, пользуются термостатами, которые обеспечивают высокую относительную влажность. Это особенно важно при высоких температурах инкубации.

4. Для высокотемпературных термостатов пользуются в качестве рабочей жидкости 50%-ным полиэтилен-гликолем или легким силиконовым маслом.

Для получения температурной зависимости роста бактерий измеряют скорости роста при нескольких тщательно контролируемых температурах и располагают данные, как показано на рис. 6.1. Если в целом форма кривой значительно отличается от нормального распределения, еще раз более тщательно проверяют экспериментальные точки.

Ряд термостатов с температурными градиентами описан в обзоре Пэтчинга и Роуза [31]. Эти термостаты позволяют контролировать рост бактерий в более широких температурных интервалах и содержат устройства для аэрации культур микроорганизмов с различными потребностями в кислороде. Такие термостаты с температурными градиентами нужны при измерении некоторых параметров роста. Пока этих термостатов нет в продаже, но их можно легко изготовить в мастерских.

6.4. ДАВЛЕНИЕ

Высокое гидростатическое давление оказывает неблагоприятное влияние на рост и выживание бактерий. Хотя в интервале давлений 1—100 атм большинство видов бактерий малочувствительно к нему, при этом давлении не удается выделить чистую культуру обли-гатно-барофильных бактерий [8]. Исследования культур в условиях высоких давлений весьма ограничены, и мы не будем здесь останавливаться на соответствующих методах. Маркиз {8] предложил некоторые методические приемы выращивания культуры при высоком давлении. Тэйлор и Янах [33] разрешили одну из основных проблем в данной области: они сконструировали аппарат, который позволяет в условиях высокого давления вносить в культуру добавки и отбирать пробы, не вызывая при этом перепадов давления.

6.5. КИСЛОРОД

Аэробные и факультативно-анаэробные бактерии утилизируют растворенный кислород, и поэтому их рост и метаболизм зависят от концентрации кислорода в растворе. Растворенный кислород является таким же питательным компонентом, как глюкоза или аммоний, однако в отличие от большинства подобных компонентов он довольно плохо растворим (<10 мг/л). Поэтому для бактерий, выращиваемых в жидких средах, кислород может быстро стать лимитирующим фактором, если не принимаются специальные меры, обеспечивающие его постоянную подачу и растворение в среде во время роста бактерий.

Отметим следующие основные факторы, на которые следует обратить внимание при аэрации жидкой культуры.

1. Доступность кислорода на границе раздела фаз питательная среда — газ. Сосуд с культурой следует закрывать пробкой или крышкой из пористого материала, так чтобы обеспечивался максимальный газообмен.

2. Поддержание большого отношения площади контакта газа с жидкой средой к объему последней. Со стационарными культурами это удается при использовании очень плоских сосудов. Благодаря встряхиванию колб на качалках площадь поверхности среды значительно увеличивается, причем этот эффект еще больше усиливается при создании турбулентных потоков среды за счет углублений в боковой части колб или при помещении в них изогнутой стальной пружины. С увеличением объема перемешиваемой культуры происходит быстрое падение ее насыщения кислородом.

При работе с большими объемами среды (0,5—1 л) обычно продувают через жидкость воздух. В таких культурах эффективность растворения кислорода зависит от числа и минимального размера воздушных пузырьков, а также от длительности контакта между пузырьками и жидкостью. При использовании газовых барботеров с малыми размерами пор получают мелкие пузырьки, однако при этом возникают условия, способствующие образованию пены. Длительность контакта между пузырьками и жидкостью можно увеличить, используя сосуды с большим отношением высоты к диаметру; этот же эффект достигается путем перемешивания культуры или с помощью перегородок в сосудах.

Системы аэрации при культивировании бактерий подробно обсуждаются в гл. 10, а также в работах Пир-та [10] и Уэнга и др [15].

6.5.1. Растворенный кислород

Для измерения растворенного кислорода наиболее подходящим способом является полярография с помощью кислородного электрода, принципы и методические приемы которой описаны ниже (разд. 16.2.3). Подробности методов с использованием полярографа для измерения скоростей растворения кислорода в культурах можно найти у Пирта [10], Уэнга и др. '[15] и Хитчмэ-на [4].

6.5.2. Скорость поглощения кислорода

Скорость поглощения кислорода (СПК) выражается в миллимолях на литр в минуту и легко определяется химически по скорости окисления сульфита в сульфат растворенным кислородом в присутствии медного катализатора. Этот метод дает информацию об эффективности системы аэрации, однако истинная СПК в бульонных культурах может значительно отличаться от СПК в водных растворах сульфита натрия. Существует ряд способов измерения СПК в средах как в присутствии биомассы, так и в ее отсутствие [1, 10, 15]. Ниже приводится простой метод измерения СПК по окислению сульфита [23],

1. Вместо ростовой среды используют соответствующий объем раствора сульфита натрия, содержащего 0,001 М сульфата меди, с той же степенью аэрации и при той же температуре, которые характерны для изучаемой среды. Концентрация сульфита натрия в каждом случае зависит от условий аэрации (см. ниже).

2. В различные интервалы времени после начала аэрации вносят дважды по 5 мл раствора сульфита в пробирки размером 2,5X25 см, содержащие небольшие кусочки сухого льда. Выделяющийся С02 перемешивает образец во время титрования и, покрывая его, препятствует дальнейшему окислению. Если образец замерзает, подогрейте его перед окончанием титрования.

3. Добавляют несколько капель крахмального раствора и титруют раствор сульфита до постоянного голубого окрашивания свежеприготовленным раствором иода, который калиброван по стандартному раствору тиосульфата натрия. Нормальность раствора иода должна составлять около Vs нормальности раствора сульфита.

4. СПК рассчитывают следующим образом:

Разность по результатам титрования (мл) х ХНормальность раствора иода

1000 мл 1 ^ 5 мл мин *

Следует отметить, что по этому уравнению можно рассчитать концентрации сульфита и иода, соответствующие данной эффективности аэрации. Например, если СПК составляет около 3, то использование 0,15 н. раствора иода приводит к разности по результатам титрования около 4 мл за 10 мин. Начальная концентрация сульфита натрия должна быть в пять раз боль

страница 33
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.09.2017)