Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

сли же это влияние, хотя и очень незначительное, все-таки существует, проводят окончательную коррекцию рН перед добавлением последних нескольких миллилитров воды во время разведения раствора.

2. Готовят эквимолярные концентрации кислых и основных компонентов системы и смешивают два раствора в соответствующих пропорциях, так чтобы установился необходимый рН. Один раствор титруют другим на рН-метре, используя магнитную мешалку. Если требуемое значение рН близко к рК, то соотношение между кислым и основным растворами равно примерно 1:1. Если рН на одну единицу выше р/С, то это отношение составляет 1 : 10; при величине рН ниже рК на одну единицу оно равно 10: 1. Например, для приготовления 100 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, рН 7,0, смешивают примерно в равных пропорциях растворы 0,1 М NaH2P04 (одноосновного) и 0,1 М Na2HP04 (двухосновного), а затем добавляют избыток одного из этих растворов и, контролируя процесс с помощью рН-мет-ра, доводят рН до 7,0. Для приготовления приблизительно 100 мл фосфатного буфера, рН 6,0, титруют 95 мл одноосновного раствора двухосновным.

Для бактериальных ростовых сред наиболее широко используются фосфатный, трис-солянокислый, цитрат-ный и ацетатный буферы. Эти четыре буферные системы охватывают практически весь интервал значений рН, в котором могут расти бактерии. В табл. 6,3 приведены смеси, используемые для приготовления буферов, а также соотношения компонентов для получения данного рН смеси. Как упоминалось выше, рН любого буфера зависит от температуры. Таблицы для приготовления других смесей, обладающих буферным действием при различных температурах, приведены во многих руководствах [2, 3, 9, 16].

При инкубации культур в атмосфере, обогащенной СОг, как правило, используют буфер, содержащий угольную кислоту и бикарбонат. Концентрация в среде угольной кислоты (Н2С03) прямо зависит от парциального давления С02 в атмосфере. Согласно уравнению Гендерсона — Хассельбаха для этой системы

, нсо3pH = p*'+lg с03 .

х мл 0,1 М лимонной кислоты+(50—х) мл 0,2 М Na-jHPO^ довести водой до 100 мл

г х мл 0,2 М NaH2PO4+(50— х) мл 0,2 М Na2HP04, довести водой до 100 мл.

50 мл 0,2 М триса f-лс мл 0,2 М HCI, довести водой до 100 мл.

величина р/С' при 20 °С составляет около 6,4. Отсюда молярное соотношение между СО2 и бикарбонатом (НС03~) равно ~1 : 1 при этом значении рН, а С02-би-карбонатный буфер эффективен в диапазоне рН 5,4—8,0. Если рН среды ниже 5,0, то в ней практически отсутст

вует бикарбонат, и увеличение концентрации С02 в атмосфере будет приводить к снижению рН за счет образования угольной кислоты. При концентрации С02 в атмосфере от 50 до 100% среда должна быть очень щелочной для поддержания уровня рН, близкого к нейтральному. Однако следует помнить, что присутствие в среде солей в высоких концентрациях может оказаться токсичным для бактерий.

После соответствующего преобразования уравнение Гендерсона — Хассельбаха можно использовать для определения количества бикарбоната, добавляемого в среду в качестве буфера при данном значении рН и различном содержании С02 в атмосфере. Для расчетов используют уравнение

lg (HCCY) = рН - р/С' + lg Р (а) (%ССд (5,87-10"'),

где Р — атмосферное давление в мм рт. ст., а — растворимость С02 (в мл) в 1 мл воды, а %СОг— процентное содержание С02 в атмосфере. Если атмосферное давление равно 720—760 мм рт. ст. (примерно 96,0— 101,3 кПа), то его колебания оказывают незначительное влияние. Поэтому в большинстве случаев можно использовать следующее упрощенное уравнение:

lg (НС03~) = рН - рК' + lg а (%С02) (4,35- Ю-*).

Величины а и р/С' для различных температур приведены в табл. 6.4. Подробности использования карбонатных буферов можно найти в работе Умбрейта и др. [351.

Обычные буферы не могут стабилизировать значения рН сред, используемых для выращивания бактерий, образующих большое количество кислоты (например, молочнокислых). В этом случае кислоту следует максимально быстро нейтрализовывать, добавляя к среде тщательно измельченный мел (СаС03). При добавлении порошкообразного мела (0,3%) к агару в чашках удобно наблюдать за образованием кислоты растущими колониями. Однако в этом случае необходимо убедиться, что мел был хорошо суспендирован в агаре при его разливе по чашкам. Колонии, образующие кислоту, формируют вокруг себя зоны просветления. Кислоту можно также удалить в системе культивирования с диализом (разд. 10.3.4).

6.1.3. Постоянный контроль

В тех случаях, когда рН культуры необходимо поддерживать в узком интервале, используют систему автоматического поддержания значений рН. Такая система должна включать рН-метр, стерилизуемые паром рН-электроды, устройство для поддержания заданного рН и насосы для добавления кислоты или щелочи. Большинство систем обычно оснащено самописцем, обеспечивающим постоянную регистрацию рН. Автоматические системы выпускает ряд фирм: New Brunswick Scientific Co., New Brunswick, N. J.; The Vir Tis Co., Inc., Gardiner, N. Y.; Cole-Palmer Instrument Co., Chicago, 111.). Имеются в продаже также стерилизуемые паром рН-электро-ды в различных наборах (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, Calif.; Ingold Electrodes, Lexington, Mass.; Leeds and Northrup, North Wales, Pa.).

Точность системы рН-контроля следует достаточно регулярно проверять с помощью отдельного рН-метра. При этом могут возникнуть следующие проблемы:

1) неправильное или недостаточное заземление системы;

2) старение стеклянных рН-электродов при их стерилизации паром; 3) загрязнение мембраны электрода сравнения компонентами среды и продуктами бактериального метаболизма в процессе длительной работы. Наиболее часто мембрана загрязняется белками и сульфидом серебра, который образуется в результате реакции хлористого серебра в электроде сравнения с содержащими серу компонентами среды. Белки удаляют выдерживанием электродов в растворе протеазы (например, про-назы), а сульфид серебра — обработкой электродов кислым раствором тиомочевииы.

6.2. АКТИВНОСТЬ ВОДЫ И ОСМОТИЧЕСКОЕ ДАВЛЕНИЕ

Вода необходима клеткам для их метаболизма и роста. Однако просто присутствие воды еще не означает, что она доступна для клетки. Доступность воды определяется ее активностью в среде (aw). Величина aw отражает лишь доступную часть всех молекул воды и численно равна отношению давления водяных паров над раствором к давлению паров над чистой водой (р/ро). Это отношение, выраженное в долях единицы, численно равно относительной влажности атмосферы над средой в состоянии равновесия (выражаемой обычно в процентах) [10—12, 14]. Колебания температуры в пределах, обеспечивающих рост бактерий, влияют на величину aw незначительно.

Величина aw и истинная осмоляльность среды связаны соотношением

aw— 55,51 l(vm-{- 55,51),

где v — число ионов, образуемых на одну молекулу раствора, т — моляльность жидкости и Ф — моляльный осмотический коэффициент. Один килограмм воды содержит 55,51 молей.

Осмотическое давление раствора (я), выраженное в атмосферах, зависит от концентрации раствора:

vti ф RT

Я:

где п — число молей, присутствующих в растворе, R — газовая постоянная (0,0821 л-атм-моль-1 -град1-), Т — абсолютная температура (°С4-273°С), V — объем растворителя.

Соотношение между я и aw имеет вид

где V — объем 1 моля воды. Подробности, касающиеся приведенных уравнений, можно найти в работах [10, 12, 14].

Минимальное значение aWt при котором бактерии способны расти, значительно варьирует, однако для большинства видов оно превышает 0,99. Некоторые га-лофильные бактерии нуждаются в ионах натрия и лучше всего растут в присутствии высоких концентраций хлористого натрия (аш«0,80). Колебания величины aw могут оказывать влияние на скорость роста бактерий, их состав и метаболическую активность. Многие растворенные вещества оказывают выраженное специфическое действие при концентрациях, ниже необходимых для лимитирования доступности воды. Поэтому определение лимитирующих значений aw следует проводить в средах, содержащих по возможности различные связывающие воду вещества. Обзоры работ по влиянию aw на рост бактерий можно найти в литературе [12, 14, 32].

Предложен ряд методов измерения активности воды с помощью специальных приборов: вибратора Брэди (Thunder Scientific Co., Albuquerque, N. M.), индикатора относительной влажности, модель 400 (General Easter Corp., Watertown, Mass.), гигрометра (Hygrodyna-mics, Silver Spring, Md.) и синаскопа (Sina Ltd., Zurich, Switzerland). В США эти приборы продает фирма Вес-kman Instruments, Inc., Cedar Grove, N, J. Достоинства и недостатки приборов обсуждаются в работах [11, 14].

Данные сравнительного изучения [27] методов определения aw свидетельствуют о значительной вариабельности результатов, получаемых с помощью различных методов, причем достоверность цифр после второго десятичного знака весьма сомнительна. Статистический анализ измерений, проведенных на электронном синас-копе (в пределах aw 0,755—0,967), показал разброс меньше ±0,01 [34].

Наиболее широко используемые приборы для определения осмотического давления основаны на измерении снижения давления пара (Wescan Instruments, Santa Clara, Calif.) или точки замерзания (Advanced Instruments, Needham Height, Mass.). На других приборах измеряют осмотическое давление, возникающее по обе стороны от полупроницаемой мембраны (Schleicher and Schuell Co., Keene, N. H.). Несмотря на то что часть приборов уже откалибрована для прямой регистрации, следует одновременно с пробами использовать стандартные растворы. Имеются приборы для измерения различных интервалов осмотического давления в пределах 0—4 ос-молей (моляльность идеального раствора, характеризуемого теми же величинами aw и осмотического давления, что и исследуемая проба).

Лучший способ стандартизации aw и осмотического давления бактериологических сред заключается в добавлении таких компонентов, как хлористый натрий, хлористый калий, сульфат натрия или смесей этих солей. Скотт [32] подробно описывает методы расчета aw питательных сред и концентраций солей, необходимых для получения заданных значений aw.

Связь между ос

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2017)