ive bacteria Methods Enzymol., 31 A, 653—667 (1974).

11. Schaechterle G. E., Pollack R. L. A simplified method for quantified assay of small amounts of protein in biological material. Anal. Bio-chem., 51, 654—655 (1973).

12 Steinberg W. Properties and developmental roles of the lysyl- and tryptophanyl-transfer ribonucleic acid synthetases of Bacillus subti-Us: common genetic origin of the corresponding spore and vegetative enzymes. J. Bacteriol ,118, 70—82 (1974).

13. Sykes J. Centrifugal techniques for the isolation and characterization of sub-cellular components from bacteria, p. 55—207. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5B. Academic Press, Inc., New York, 1971.

14. Work E. Cell walls, p. 361—418. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5A. Academic Press, Inc., New York, 1971.

Часть II

РОСТ

ВВЕДЕНИЕ Р. Костилоу

Начиная с изящной работы Роберта Коха, сделанной еще в середине XIX столетия, методы выращивания бактерий стали основной заботой бактериологов. Для выращивания различных видов и штаммов микроорганизмов в самых различных целях были предложены буквально тысячи методик и сред. Однако все эти методики базируются на определенных общих принципах.

Для размножения любой бактерии (независимо от целей) необходимо обеспечить подходящее биофизическое окружение и биохимические питательные компоненты. В гл. 6 приведены методы контроля таких биофизических факторов, как рН, температура, подача и удаление кислорода, и другие. В гл. 7 рассмотрены потребности в питательных веществах, состав синтетических и комплексных сред и количественные определения роста бактерий. Умелое обращение с биофизическими, биохимическими и биологическими факторами приобретает особую важность в получении накопительных культур и последующего выделения бактерий в виде чистой культуры (гл. 8).

Способы культивирования бактерий значительно различаются, причем это зависит не только от потребностей организма, но и от того, для чего будет использоваться культура. Для выделения чистых культур, определения числа жизнеспособных клеток в популяциях и для многих других целей широко используются твердые среды. Гелеобразующие вещества и специальные методы приготовления твердых и полужидких сред рассматриваются в гл. 9. В гл. 10 описываются различные системы для жидких культур: стационарная, или периодическая, проточная, диализная — и другие специальные системы, а также методы сбора, отмывки и учета урожая бактерий.

Ростом обычно называют постепенное увеличение всех биохимических компонентов индивидуума. Для бактерий наиболее характерным результатом роста является увеличение числа клеток, т. е, их размножение. В гл. 11 описаны различные методы измерения количества клеток и математические приемы, используемые при учете и статистической обработке результатов.

Современные методы хранения чистых культур обсуждаются в гл. 12. Можно было бы составить целый «Журнал невоспроизводимых результатов», в котором были бы собраны данные, свидетельствующие о неумении исследователей сохранять необходимые бактериальные штаммы. В некоторых журналах существует требование, согласно которому каждая использованная в опубликованной работе культура должна быть помещена в какую-либо известную коллекцию. К сожалению, это не всегда позволяет избежать неудач, поскольку при хранении бактерии мутируют и при частых пересевах культура обогащается мутантными формами.

Из многих методов выращивания бактерий авторы выбрали только те, которые, по их мнению, являются наиболее приемлемыми. Там, где это возможно, приведены очень ценные обобщения, главным образом в виде таблиц, включающих составы сред (гл. 7). В некоторых случаях авторы ограничиваются изложением общих принципов и примерами использования методов. Это относится, в частности, и к тем распространенным методам, описания которых в литературе страдают многословием и противоречивостью трактовок. Во всех главах, входящих в данную часть, рассмотрены также наиболее общие причины ошибок.

Глава 6

БИОФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Р. Костилоу

Выбор основных компонентов среды культивирования определяет в известной мере значения таких важных биофизических параметров, как рН, активность воды, осмотическое давление. Температура, аэрация и давление определяются условиями культивирования. Другой важный параметр — окислительно-восстановительный потенциал зависит как от состава ростовой среды, так и от условий культивирования. Все эти факторы влияют на скорость роста, выход биомассы, метаболизм и химический состав бактерий. Контроль щелочно-кис-лотных условий, температуры и аэрации является критическим для любой бактериальной культуры; контроль окислительно-восстановительного потенциала особенно важен при культивировании облигатно-анаэробных бактерий.

6.1. рН

рН служит показателем активности ионов водорода (Н+). В разбавленных растворах коэффициент активности очень близок к 1, и поэтому активность Н+ практически равна концентрации. В таком случае рН^—lg[H+] Шкала рН начинается от 0([Н+] —1 М) и заканчивается 14-ю ([Н+] = 10-14 М). Хотя некоторые бактерии растут при рН 1,0, а другие при рН 11, многие виды растут в относительно узком интервале рН, а большинство из них — при значениях рН, близких к 7,0.

6.1.1. Измерение

Для точного определения рН пользуются рН-метром со стеклянным электродом. В разд 16 2.1 приведено описание водородного электрода, методов, используемых для калибровки рН-метров, и способов обращения с Электродами. В работе Манро [9] можно найти детальное описание измерения и контроля рН. Когда необхо* димо точное измерение рН, следует придерживаться следующих правил.

1. Доводить температуру буфера, используемого для калибровки рН-метра, до температуры измеряемой пробы, поскольку рН буфера зависит от температуры. Так, рН стандартного фосфатного буфера равен 6,98 при 0°С, 6,88 при 20 °С и 6,84 при 37 °С. Значения рН стандартных буферов при различных температурах приведены в «Справочнике по химии и физике» [16].

2. Если проба во время измерения перемешивается на магнитной мешалке, то таким же путем нужно перемешивать стандартный буфер.

3. Определять рН сред после стерилизации. Автокла-вирование сред часто приводит к заметным сдвигам рН. Значительный сдвиг рН может происходить даже после стерилизации фильтрованием.

4. Проверять рН среды перед использованием.

5. Поскольку некоторые рН-электроды дают неточные результаты при работе с трис-буфером, необходимо

прежде всего убедиться в том, что электроды пригодны

для работы с этим буфером.

В тех случаях, когда нет необходимости в высокой точности измерений, например при работе с обычными средами, рН определяют с помощью раствора индикаторного красителя или индикаторной бумаги. При правильном их подборе рН можно измерить с точностью до 0,2 единицы. Индикаторные растворы и бумаги, а также их соответствующие стандартные образцы определенного цвета для различных интервалов рН поставляются большинством фирм, производящих реактивы и научное оборудование. В табл. 6.1 приведены наиболее часто употребляемые рН-индикаторы и диапазоны рН, в которых они используются.

Некоторые рН-индикаторы часто добавляют к среде культивирования с целью выявить изменение рН в процессе роста бактерий. Для этого нужно подобрать соответствующий задаче рН-индикатор и убедиться, что он не подавляет рост микроорганизма. Все рН-индикаторы плохо растворимы в воде и используются в средах в очень низких концентрациях (менее 0,01%).

6.1.2. Буферы

Многие бактерии используют или приводят к накоплению в растворах значительных количеств кислых или щелочных ионов. Хотя образование кислоты и ее потребление сбалансированы, в процессе роста могут происходить значительные изменения рН среды. Грубо рН культуры поддерживают с помощью добавляемых к среде буферов, т. е. веществ, препятствующих сдвигам значений рН. Тонкий контроль за щелочно-кислотными условиями достигается при автоматической подаче в среду культивирования кислоты или щелочи.

Буферы обычно представляют собой смеси слабых кислот и оснований. В комплексных средах буферным действием обладают кислые и основные группы таких органических молекул, как белки, пептиды и аминокислоты. Из-за присутствия различных веществ среды могут обладать буферным действием в широком интервале рН. Однако буферная емкость при любом заданном значении рН широко варьирует в зависимости от типа присутствующих в растворе органических молекул и их концентрации.

Для культивирования многих бактерий необходимо применять забуференные среды. При выборе соответствующего буфера исходят из: 1) подходящего значения рН буфера, 2) возможного ингибирующего или токсического действия буфера, 3) возможной утилизации компонентов буфера бактериальной культурой, 4) возможного связывания буфером двух- и трехвалентных металлов.

Буферы со слабыми кислотными и основными свойствами наиболее эффективны вблизи значений рН, при которых они диссоциируют на 50%. Эта величина рН соответствует рКа (отрицательный логарифм константы диссоциации) кислоты или основания. Эффективный диапазон буфера отличается от величины рКа не более чем на одну единицу рН. В табл. 6.2 приведен ряд соединений, которые используются в качестве буферов в ростовой среде, а также их наиболее пригодные значения рКа при 25°С. Обратите внимание, что соли лимонной, фталевой и янтарной кислот обладают буферной емкостью в широком интервале значений рН, поскольку соответствующие им кислоты содержат более одного диссоциируемого иона водорода. Буферы, содержащие перечисленные в таблице вещества, обычно готовят согласно одной из следующих методик.

1. Сначала готовят раствор кислоты или основания в концентрации, вдвое превышающей необходимую, титруют его NaOH или НС1 на рН-метре до необходимого значения рН и затем доводят раствор до конечного объема. Например, для приготовления 1 л 0,1 М трис-HCl-буфера с рН 7,6 титруют 500 мл 0,2 М раствора триса с помощью НС1 до рН 7,6 и затем доводят раствор до 1 л. Разведение почти не влияет на конечную величину рН. Е