Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

После полимеризации образовавшиеся лунки промывают несколько раз электродным буфером, содержащим небольшое количество бромфено-лового синего. При этом удаляется непрореагировавший персульфат, а границы лунок слегка окрашиваются, так что их можно видеть при нанесении проб. Верхний электродный буфер содержит 0,182 М глицин, 0,0255 М трис (конечное значение рН 8,3) и 0,1% ДСН. Нижний электродный буфер содержит те же компоненты, за исключением ДСН.

Пробы растворяют в буфере для концентрирующего геля, к которому добавлены 12,5% глицерина, 1,25% ДСН и 1,25% 2-меркаптоэтанола. До электрофореза их прогревают в течение 5 мин в кипящей водяной бане для того, чтобы прошла полная диссоциация и денатурация всех белков. В качестве красящей метки к пробам можно добавить бромфеноловый синий или феноловый красный. Окончательно приготовленные пробы должны содержать 1—5 мг/мл белка, причем в маленькие лунки (3X0,75 мм) достаточно вносить 5—25 мкг белка. Так как проводимость геля меняется по мере прохождения через него концентрирующего буфера, следует поддерживать постоянными напряжение или мощность, а не ток.

Пока исследуемая смесь не вошла в разделяющий гель, устанавливается начальное напряжение, равное 50 В; затем напряжение повышают до 145 В на весь остаток пути. Для наилучшего разрешения температура геля должна быть 25 °С.

Самый распространенный недостаток электрофореза в полиакриламиде состоит в искривлении полос вследствие неправильно проведенной полимеризации. Чтобы этого не было, гелевые растворы нужно тщательно дегазировать перед заливкой, а верхнюю кромку разделяющего геля после полимеризации несколько раз промывать, чтобы удалить все остатки незаполимеризовавше-гося геля. Реактивы для электрофореза бывают разными по чистоте, и для того, чтобы время полимеризации было всегда постоянным, необходимо увеличивать или уменьшать количество персульфата аммония. Для разделяющего геля оптимальное время полимеризации составляет ~30 мин. При большей длительности гель становится мягким или не полностью полимеризуется, а при меньшей — полимеризация может пройти неравномерно, что приведет к появлению волнистых белковых полос. Персульфат аммония очень гигроскопичен и не отличается стабильностью. Рекомендуется готовить исходный концентрированный раствор персульфата аммония (50 мг/мл), который хранят в замороженном состоянии порциями по 1 мл. Такой раствор стабилен в морозильной камере в течение нескольких месяцев.

Полосы могут быть также размазанными из-за присутствующих в пробе липидов и гликолипидов (распространенный случай — присутствие липополисахаридов). Липиды связывают значительную часть ДСН, и фактически их присутствие может привести к истощению ДСН, доступного для связывания с белками, мигрирующими в геле. Эту трудность преодолевают, увеличивая количество ДСН в верхнем электродном буфере до 1 % и выше.

Гели окрашивают по методу Фейербенкса и др. [2]. При слабом покачивании гели вымачивают по 1 ч в каждом из следующих растворов: 1) 525 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 1,0 г кумасси ярко-синего и 1275 мл воды; 2) 210 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,1 г кумасси ярко-синего и 1590 мл воды; 3) 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,05 г кумасси ярко-синего и 1800 мл воды и 4) 10%-ная уксусная кислота. После полного обесцвечивания геля его вымачивают перед высушиванием в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 1 % глицерина.

5.3. ПРИМЕР ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ: Е. coli

5.3.1. Полное фракционирование

Схему, показанную на рис. 5.1, можно использовать для определения внутриклеточной локализации какого-либо фермента или белка, принадлежащего Е. coli или другим кишечным бактериям. Преимущество этой схемы заключается в том, что при низких концентрациях Mg2+ (в данном случае источником Mg2+ служат как сами клетки, так и буфер для разрушения) наружная мембрана нерастворима в тритоне Х-100, в то время как цитоплазматическая мембрана полностью растворима.

При разрушении клеток силами сдвига некоторые цитоплазматические мембраны сильно дробятся (вероятно, до небольших, «открытых» мембранных фрагментов) и их нельзя уже осаждать ультрацентрифугированием. Поэтому первую надосадочную цитоплазматическую фракцию (надосадочная жидкость I на рис. 5.1) инкубируют при 21 °С. При температуре выше температуры фазового перехода мембранных липидов крошечные фрагменты агрегируют, т. е. сливаются в мембранные фрагменты больших размеров, которые можно затем осадить i[6], В некоторых случаях неосаждаемая фракция мембран может составлять до 20—30% цитоплаз-матических мембран. Она образуется при разрушении клеток не только с помощью пресса Френча, но и при обработке их ультразвуком или даже при быстром лизисе протопластов или сферопластов.

При такой схеме фракционирования невозможно выяснить, откуда происходят растворимые белки — из цитоплазмы или из периплазмы. Для этого требуется отдельный эксперимент, в котором клетки подвергают осмотическому шоку по методике Неу и Хеппла [7] с высвобождением белков периплазмы.

Если окончательно получаемую фракцию цитоплаз-матических мембран (надосадочная жидкость III на рис. 5.1.) собираются анализировать гель-электрофореРАЗРУШЕННЫЕ КЛЕТКИ

I

НАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ 3

Инкубация ЗОмин при 27Х

ЦёнтрифугироЬание 1 ч

при 200000д

Центрифугиродание

гооооод

71

ОСАДОК

Объединение с осадком Л

НАДОСАДОЧНДЯ ЖИДКОСТЬ П (ЦИТОПЛАЗМА И ПЕРИПЛАЗМА)

ОСАДОК П

Суспендиробание объединенных осадноб до концентрации Юмг/мл белка 8 том же буфере, который исполь-зобался при разрушении клеток

Добавление тритона Х-ЮО до конечной концентрации 20мг/мл

Центрифугиродание 1ч при ЗООООд ~ТЛ

ОСАДОК Ш

(НАРУЖНЫЕ МЕМБРАНЫ)

НАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ Ш (ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕШЕ МЕМБРАНЫ)

Рис. 5.1. Схема фракционирования клеток В. coll, используемая для обнаружения локализации какого-либо фермента или белка внутри клетки. Клетки разрушают на прессе Френча в HEPES-буфере; ин-тактные клетки удаляются осаждением в течение 5 мин прн 5000 g.

зом в присутствии ДСН, белки нужно отделить от тритона Х-100 осаждением в этаноле, как описано ранее. В пробу и в верхний электродный буфер необходимо добавить большой избыток ДСН, в противном случае тритон Х-100 будет образовывать с ДСН смешанные мицеллы и мешать разделению белков в гелях.

5.3.2. Внутренняя и наружная мембраны

Клетки разрушают на прессе Френча и отделяют клеточный экстракт от целых клеток центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин, как описано ранее. Фракцию клеточных оболочек осаждают центрифугированием при 200 000 g в течение \ ч, а осадок ресуспендируют в

0,01 М HEPES-буфере, рН 7,4, так чтобы получить концентрацию белка ~20 мг/мл.

Градиенты сахарозы готовят на этом же буфере. Для ротора Beckman SW 27 (объем стакана 37 мл) мы используем 5 слоев по 7 мл каждый, содержащих следующие количества сахарозы (вес/вес): 35, 40, 45, 50 и 55 %. 2 мл суспензии с оболочками наслаивают поверх градиента и центрифугируют при максимальной скорости (131000 g) 36—48 ч. Небольшое количество осадка на дне стакана удаляют. Наружные мембраны содержатся либо в одиночной мутной полосе, либо в паре сходных полос в положении, соответствующем концентрации сахарозы примерно 52% (вес/вес). Фракция цитоплазматических мембран представляет собой прозрачную желтоватую полосу в том месте, где сахароза имеет концентрацию около 36% (вес/вес). Градиенты разливают с помощью насоса и измеряют поглощение фракций при 280 нм. Затем собирают и объединяют фракции, содержащие мембраны, объединенные фракции разводят в соотношении 1 :3 тем же HEPES-буфером, который в данном случае содержит 1 мМ MgCl2, и центрифугируют при 200 000 g в течение 2 ч для осаждения частиц мембран. Для выявления перекрестного загрязнения можно воспользоваться различными биохимическими маркерами. Цитохромы и Сук-цинатдегидрогеназа представляют собой подходящие маркеры для фракции цитоплазматических мембран. Белки наружной мембраны, называемые «главными» [1] и выявляемые в ДСН-полиакриламидных гелях, — полезные маркеры для наружной мембраны, так же как и специфические липополисахариды или фосфолипазы [8]. Наилучшие результаты мы получили на культурах, выращенных на минимальных средах с временем генерации ~1 ч и более. Мембраны клеток, выращенных на комплексных средах, по-видимому, труднее разделить, возможно, вследствие увеличения числа зон адгезии между наружной и цитоплазматической мембранами в быстрорастущих клетках.

5.4. ЛИТЕРАТУРА

1. Bassford P. J., Jr., Diedrich D. L., Schnaitman С. A., Reeves P. Outer membrane proteins of Escherichia coli VI. Protein alteration in bacteriophage-resistant mutants. J. Bacteriol., 131, 608—622 (1977).

2. Fairbanks G„ Steck T. L., Wallach D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry, 10, 2606—2617 (1971).

3. Helenius A., Simons /0 Solubilization of membranes by detergents. Biochim. Biophys. Acta, 415, 29—79 (1975).

4. Hughes D. E., Wimpenny J. W. Т., Lloyd D. The disintegration of microorganisms, p. 1—54. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5B. Academic Press, Inc., New York, 1971.

5. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during assembly of bacteriophage T4. Nature (London), 222, 293—298 (1970).

6. Macuregor С. H., Schnaitman C. Reconstitution of nitrate reductase activity and formation of membrane particles from cytoplasmic extracts of cholate-resistant mutants of Escherichia coli J. Bacteriol., 114, 1164—1176 (1973).

7. Neu H. C., Heppel L. A. The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation of spheroplasts. J. Biol. Chem., 240, 3685—3692 (1965).

8. Osborn M J., Munson R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of gram negative bacteria. Methods Enzymol, 31A, 642—653 (1974).

9. Ross J. W. Continuous-flow mechanical cell disintegrator. Appl. Microbiol., 11, 33—35 (1963).

10. Salton M. R. Isolation of cell walls from gram posit

страница 30
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.06.2017)