Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

тальной структуре и для идентификации бактерий. Электронный микроскоп устроен значительно сложнее, чем световой. Как правило, его обслуживанием и регулировкой занимаются специалисты-профессионалы, которые инструктируют, помогают и дают советы. Поэтому в гл. 4 большое внимание уделяется методическим аспектам подготовки препаратов для микроскопии. Для успешного продолжения работы, начинающейся с разрушения бактериальных клеток и их фракционирования, описываемых в гл. 5, нужна как световая, так и электронная микроскопия. При этом в качестве главного средства контроля чистоты субклеточных фракций и установления связи между структурой и функцией применяется электронный микроскоп.

Глава 1

СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ

Р. Мюррэй, К. Робиноу

Микроскопические исследования проводить легко и интересно, а их результаты отличаются четкостью, когда под рукой имеются микроскопы по крайней мере четырех различных типов. Лучше всего, если они постоянно готовы к работе и содержатся в порядке. Речь идет о 1) обычном, хорошо, но без излишеств оснащенном микроскопе, нужном для оценки в самом первом приближении, 2) фазово-контрастном микроскопе, 3) оптимально оборудованном микроскопе, настроенном на высокое разрешение деталей и приспособленном для фотографирования, и 4) люминесцентном микроскопе. Конечно, возможны различные сочетания, а иногда нужды исследователей удовлетворяются и при более ограниченном выборе.

В продаже имеются самые разнообразные микроскопы. Те из них, что производятся на лучших заводах, примерно одинаковы по качеству, а количество предлагаемых для них дополнительных приспособлений более чем достаточно. Они различаются главным образом конструкцией опорной части, и их выбирают исходя скорее всего из соображений удобства и личных симпатий. По-настоящему хорошие микроскопы дороги. Приложив усилия, можно делать хорошие работы на микроскопе общего назначения или даже на студенческом микроскопе, если оборудовать их первоклассной оптикой. Однако при этом трудно состязаться с работами, выполненными на приборах, которые поставляются лучшими фирмами-изготовителями. Выбор может зависеть также от технических требований. Всегда рекомендуется проводить прямые сравнения разных микроскопов и приспособлений на собственном материале при используемых в работе условиях. Поэтому нет необходимости обращать внимание на то, кем сделан инструмент. Главное — чтобы работа на хорошем микроскопе (независимо от времени

его изготовления) доставляла удовольствие, а широкий выбор приспособлений и умение пользоваться ими способствовали экономии времени и точности результатов. Применение плохо настроенных микроскопов с плохим освещением настолько широко распространено, что лишь немногие биологи представляют себе возможности микроскопа. Иногда исследователи приходят в изумление, когда им удается получить очень большое разрешение даже на студенческом микроскопе. Это возможно в том случае, если использовать принципы, изложенные в разд. 1.1 или 1.3 и 1.3.1.

1.1. ОБЫЧНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Микроскопы, которые используют в общих целях в учебной комнате, в исследовательской лаборатории или в клинической лаборатории, могут иметь разные марки, обладать разным качеством и предназначаться для разных условий. В бактериологии вопросы, на которые можно ответить с помощью микроскопа, формулируются следующим образом. Обладают ли изучаемые объекты размером бактерий и окрашиваются ли они так же, как бактерии? Однородны ли они по форме и размеру? Какие это бактерии — грамположительные или грамотрица-тельные? Организмы или клетки одного или более чем одного типа присутствуют в препарате? и т. д. Для выяснения этих вопросов самые первые наблюдения можно, как правило, проводить, не достигая высшей степени разрешения. Сначала исследователя может удовлетворить и упрощенная процедура, поскольку хорошо известно, что для получения более высокого разрешения улучшения можно добиться почти на каждом этапе исследования.

Микроскоп (рис. 1.1) должен иметь:

1. Окуляры по крайней мере 10-кратного увеличения. Вместе с тем для детальных исследований бактериальных структур нужны компенсационные окуляры с большим увеличением (12Х или 15х). Они закрепляются в тубусе микроскопа, который имеет фиксированную или регулируемую длину (до 180 мм или до величин, рекомендуемых заводом-изготовителем).

2—1260

2. Слабые безыммерсионные объективы (10Х и 40Х), которые необходимы для микроскопирования растущей культуры и для нахождения потенциально интересных полей зрения в препарате.

3. Ахроматический иммерсионный объектив (от 90Х до 100Х), для которого иммерсией служит масло.

4. Предметный столик с механическим препаратово-дителем или простыми пружинными зажимами. Если микроскоп снабжен препаратоводителем, последний должен легко сниматься, чтобы можно было просматривать под малым увеличением чашки Петри или окрашиваемые на предметных стеклах препараты.

5. Находящийся под столиком высококачественный

конденсор (апланатический конденсор с тремя линзами

с предпочтительной числовой апертурой от 1,3 до 1,4). Конденсор этого типа необходим для объективов, с которыми работают при масляной иммерсии, поскольку он обеспечивает требуемое для них количество и качество света. Конденсор должен иметь ирисовую (апертурную) диафрагму, находящуюся под нижней линзой.

6. Источник света, либо смонтированный внутри микроскопа и имеющий ограниченную регулировку, либо (что предпочтительнее) внешний и перемещаемый. В последнем случае под конденсором монтируется зеркало (плоское с одной стороны и вогнутое с другой), положение которого можно менять; свет направляется вверх по оптической оси микроскопа за счет наклонного положения зеркала. Из множества различных ламп для большинства работ подходит круглая матовая лампа, над которой располагается линза типа «бычий глаз». Однако при исследовании окрашенных препаратов, особенно при освещении по Кёлеру (разд. 1.3.1), изображение значительно улучшается, если использовать лампу, которая дает четкое изображение источника света, снабжена держателем для светофильтра и ирисовой полевой диафрагмой. Проекционные лампы со спиральной нитью (дающие неравномерное изображение) нужно фокусировать на матовое стекло, служащее рассеивающей перегородкой и расположенное в держателе для светофильтра лампы; затем путем регулировки отражателя, находящегося в корпусе лампы, следует сместить одно из двух изображений нити так, чтобы витки одного приходились на промежутки между витками другого, и путем небольшой расфокусировки добиться возможно более однородного и яркого освещения поверхности, служащей источником света.

При работе с микроскопом выполняются следующие операции:

1. В положении, когда окуляр и объектив 10Х занимают свои места, конденсор почти полностью поднят до уровня предметного столика, а апертурная диафрагма в конденсоре полностью открыта, зеркало поворачивают таким образом, чтобы направить свет вверх по оптической оси. Макровинтом устанавливают объектив в положение, при котором источник света находится в фокусе, после чего выводят его в центр с помощью зеркала.

2*

19

При микроскопировании, как правило, используют плоское зеркало.

2. Помещают предметное стекло с препаратом на предметный столик и фокусируют объектив до получения резкого (не обязательно хорошо освещенного) изображения объекта, которое следует максимально улучшить регулировкой апертурной диафрагмы и положения конденсора.

3. По нашему опыту лучший способ определить оптимальное положение конденсора состоит в следующем. Снимают окуляр и смотрят через тубус на заднюю поверхность линзы объектива. В это же время регулируют положение конденсора таким образом, чтобы освещение объектива было самым полным и равномерным. Любое нарушение центрировки можно выявить и исправить поворотом зеркала. Затем уменьшают блики, закрывая диафрагму конденсора (если она есть) как раз настолько, чтобы освещенный участок задней линзы объектива только-только начал уменьшаться. Эту операцию выполняют для каждого объектива при первоначальной фокусировке на данный объект.

4. Возвращают окуляр на место и производят окончательную регулировку, добиваясь наилучшего освещения.

5. Поворотом револьвера с объективами устанавливают любой другой объектив. Многие фирмы, производящие микроскопы, поставляют парафокальные объективы (т. е. объективы, у которых фокальные плоскости почти совпадают). При установке остается достаточный зазор для безыммерсионных объективов. Если же объективы не парафокальны, перед фокусированием иммерсионных объективов, имеющих малые фокальные расстояния, нужно слегка приподнять тубус микроскопа. Зазор становится еще меньше, если препарат накрыт покровным стеклом.

6. Если смотрят препарат с иммерсией, то наносят каплю масла на стекло с препаратом (в центр препарата) перед тем, как поместить его на предметный столик. Если же предварительно требуется отыскать нужное поле зрения при малом увеличении, то каплю масла удобно нанести, когда револьвер находится в промежуточном положении при переходе с одного объектива на другой, перед тем как иммерсионный объектив окажется над каплей с маслом.

7. Чтобы научиться обращаться с иммерсионным рбъективом и фокусировать его, нужен некоторый практический навык и осторожное обращение с микроскопом (разд. 1.5 и 1.6), даже если передняя часть объектива способна вжиматься в целях защиты как линзы, так и предметного стекла от микроскописта с плохими руками. Глядя сбоку на предметное стекло, опускают объектив до поверхности масляной капли, а затем еще немного. Объектив опускают осторожно при помощи макровинта и следят за появлением изображения препарата, глядя в окуляр. После того как оно появляется, пользуются микровинтом. Настраивают освещение, как описано ранее, и подбирают оптимальное на свой глаз.

8. Если изображение неясное, плывет или только тусклое и нерезкое, значит, что-то сделано неправильно. Может быть, нуждается в очистке фронтальная линза объектива (для этого используют бумагу для линз). С иммерсионными объективами часто получается плохая картина из-за пузырь

страница 3
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)