Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

четливо влияет ряд факторов, включая фазу роста, на которой собраны микроорганизмы, способы промывания клеток после отбора и тип культуральной среды. В связи с описанной выше методикой Осборн и Мунсон [8] отмечают, что клетки, выращенные на комплексной среде, лучше образуют сферопласты, а предварительная инкубация клеток в холодном буфере до перенесения их в раствор сахарозы сказывается отрицательно на образовании сферопластов. В целом для приготовления сфе-ропластов или протопластов лучше всего использовать клетки, находящиеся в середине логарифмической фазы роста.

5.1.6. Осмотическое лизирование

Сферопласты или протопласты эффективно лизиру-ются при быстром 10—20-кратном разведении разбавленным буфером или дистиллированной водой. Размер образующихся при этом везикул в определенной степени зависит от быстроты и кратности разведения. Часто применяют методику осаждения протопластов или сферопластов центрифугированием с последующим суспен-дированием их в лизирующем буфере. Такие осадки можно быстро и равномерно суспендировать при помощи шприца (в частности, пружинного шприца, снабженного оксфордовским [Oxford Laboratories] шприцевым пипеттором с иглой большого диаметра или канюлей. Несколько энергичных движений поршнем шприца позволяет быстро и равномерно суспендировать смесь.

В интактных клетках бактерий дезоксирибонуклеино-вая кислота (ДНК) включена в структуру нуклеоида. Эта структура стабилизируется рибонуклеиновой кислотой (РНК), и поэтому присутствие следов рибонуклеа-зы приводит к разворачиванию нуклеоида во время лизиса и образованию очень вязкого раствора высвободившейся ДНК. Трудности, связанные с высокой вязкостью, можно преодолеть несколькими путями. Цепи молекул ДНК можно разрезать короткой обработкой ультразвуком или гомогенизацией суспензии лизирован-ных клеток в ножевом микроизмельчителе. Можно также добавить в раствор дезоксирибонуклеазу, но для функционирования этого фермента необходим Mg2+ в концентрации не менее 0,1 мМ. Если сферопласты ли-зируются в присутствии ЭДТА, то требуется избыток Mg2+ по сравнению с содержанием ЭДТА.

5Л.7. Замораживание—оттаивание

Замораживание — оттаивание используют для того, чтобы сделать грамотрицательные клетки чувствительными к лизоциму или детергентам. Этот метод можно применять при выделении мембран или внутриклеточных органелл в больших количествах.

Для выделения больших количеств мембран из Е. coll полезна следующая методика. Густую суспензию отмытых клеток (клетки составляют около 30% объема суспензии) в 0,02 М трис-буфере, рН 7,8, содержащем 5 мМ ЭДТА, 0,25 М сахарозы и 0,5 мг/мл лизоцима, помещают в колбу и замораживают в виде тонкого слоя, вращая колбу в ацетоновой бане с сухим льдом. Затем суспензию размораживают, погружая колбу в теплую воду, и, как только все растает, выливают содержимое в 20 объемов холодного буфера, имеющего состав: 0,02 М трис, 0,5 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл дезоксирибону-клеазы, рН 7,8. Смесь немедленно обрабатывают около 20 с в ножевом микроизмельчителе, чтобы измельчить ДНК и разрушить клетки. Неразрушившиеся клетки удаляют центрифугированием в течение 5 мин при 5000 g. Если осадка много, его вновь суспендируют в указанном выше растворе трис-ЭДТА-сахарозы и повторяют цикл замораживания — оттаивания с последующим разведением. Клеточные оболочки, состоящие из наружной и внутренней мембран, получают центрифугированием при 27 000 g в течение 20 мин.

5.2. МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ

5.2.1. Дифференциальное центрифугирование

Для получения клеточных фракций широко применяются различные виды центрифугирования: дифференциальное центрифугирование, зональное центрифугирование и равновесное центрифугирование в градиенте плотности. Теоретические и практические вопросы, связанные с центрифугированием, всесторонне разобраны в обзоре Сайкса [13].

В случае дифференциального центрифугирования образцы центрифугируют определенное время при задание

ной скорости, после чего удаляют надосадочную жидкость. Этот метод полезен для разделения частиц, сильно различающихся по скорости седиментации. Например, центрифугирование в течение 5—10 мин при 3000— 5000 g приводит к осаждению интактных бактериальных клеток, тогда как большинство клеточных фрагментов при этом остается в надосадочной жидкости. Фрагменты клеточной стенки и большие мембранные структуры можно осадить центрифугированием при 20000—50 000 g в течение 20 мин, в то время как маленькие мембранные везикулы и рибосомы требуют для осаждения центрифугирования при 200 000 g в течение 1 ч.

5.2,2. Зональное центрифугирование

Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах; для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем); большинство этих частиц в достаточной степени разделяется центрифугированием при 100000 g в течение 1—4 ч.

5.2.3. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности

При этом виде центрифугирования частицы разделяются по плавучей плотности, а не по скорости седиментации. Метод широко применяется для разделения различных фракций мембран, так как фрагменты мембран, относящиеся к одному и тому же типу, могут сильно

различаться по размеру (и, следовательно, скорости седиментации), но должны иметь одинаковую плавучую плотность. Исследуемые компоненты движутся при центрифугировании в градиенте плотности растворенного вещества (для мембран и органелл с плотностью ниже 1,3 г/мл обычно используются сахарозные градиенты, а для более плотных структур, таких, как вирусы, применяют соли винной кислоты и хлористый цезий) до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное положение, при котором плотность каждой частицы равна плотности окружающего раствора. Поскольку растворы сахарозы относительно вязкие, градиенты, как правило, формируют заранее. У растворов хлористого цезия вязкость низкая, так что трудно заранее приготовить его градиентный раствор; в этом случае применяют технику изопикнического центрифугирования в градиенте плотности. Пробу смешивают с хлористым цезием в количестве, достаточном для создания плотности, равной средней плотности субклеточных частиц. Эту гомогенную смесь помещают в сосуд для центрифугирования, и в результате седиментации хлористого цезия в поле центробежных сил при центрифугировании формируется его градиент.

Поскольку скорость седиментации частицы постепенно снижается по мере достижения ею той области градиента, где она имеет плотность одинаковую с плотностью раствора, для достижения равновесия центрифугировать требуется очень долго. Это особенно важно для маленьких мембранных везикул, таких, как хрома-тофоры, или для фрагментов цитоплазматических мембран клеток, разрушенных на прессе Френча, так как скорость седиментации этих частиц низка даже в отсутствие градиента. Если применять центробежные ускорения порядка 100 000—200 000 g, для более или менее хорошего разделения требуется не меньше 24 ч, а для полного — 72 ч.

5.2.4. Градиенты сахарозы

Концентрация сахарозы в растворах для приготовления градиентов указывается в литературе по-разному: в единицах плотности, в молях сахарозы, в весовых процентах сахарозы (вес/вес), в процентах на единицу объема (вес/объем или г/100 мл). В стандартных химических справочниках есть таблицы для перевода концентраций водных растворов сахарозы из одних единиц в другие. Чаще всего используются весовые проценты сахарозы. При приготовлении сахарозных растворов плотность воды или разбавленных буферов принимают равной 1 г/мл. Следовательно, чтобы приготовить, например, раствор 54% -ной (вес/вес) сахарозы, нужно растворить 54 г сахарозы в 46 мл воды. При этом образуется 100 г раствора, а поскольку плотность 54%-ного (вес/вес) раствора сахарозы равна 1,2451, конечный объем будет 80,3 мл. Приготовление растворов таким путем устраняет необходимость доведения вязких растворов до фиксированных величин объема.

Для создания градиентов промышленностью выпускаются разнообразные устройства, но их применение не обязательно, так как удовлетворительные по качеству градиенты можно приготовить, наслоив друг на друга в центрифужном стакане ряд сахарозных растворов и выдержав в течение ночи, чтобы за счет диффузии образовался непрерывный градиент. Нет необходимости выдерживать градиенты, которые будут центрифугироваться 24 ч и больше, так как за время центрифугирования благодаря диффузии сформируется непрерывный градиент. Мы обычно готовим градиенты из пяти-семи слоев. Когда используются смачиваемые центрифужные стаканы, например, из нитроцеллюлозы или поликарбоната, слои можно наносить, давая им стекать вниз по стенке стакана из пипетки, которую держат под углом к стенке. Если берут несмачиваемые стаканы, такие, как полиалломерные или полипропиленовые, то кончик пипетки при добавлении раствора должен находиться в контакте с мениском, чтобы не происходило перемешивания.

Самый простой метод отбора фракций из сахарозных градиентов заключается в их выкачивании с помощью перистальтического насоса. Центрифужный стакан зажимают в круглых лапках (мы применяем кусок прозрачного плекса с просверленным по диаметру стакана отверстием, который зажимаем в лапках), а над ним в круглых лапках закрепляют трубочку небольшого

диаметра из нержавеющей стали. Трубочку подсоединяют к насосу и опускают в стакан до соприкосновения с дном. Затем градиентный столбик с помощью насоса раскапывают по находящимся в коллекторе фракций мерным пробиркам.

5.2.5. Детергенты

Детергенты применяются при фракционировании клеток в трех случаях. Ко

страница 28
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.05.2017)