Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

гированием при 5000 g в течение 5 мин. Mg2+ нужен для того, чтобы функционировала дезоксирибонуклеаза; его добавляют после разрушения, чтобы предотвратить стабилизацию рибосом. Рибонуклеаза действует в отсутствие Mg2+. Можно использовать и другие буферы, например фосфатный, но трис-буфера или хелатирующих агентов следует избегать, чтобы предотвратить повреждение наружной клеточной мембраны.

Пресс Френча эффективен при разрушении грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий (особенно бацилл). Эндоспоры и грамположителъные кокки в нем не разрушаются, для этих устойчивых клеток более действенно баллистическое разрушение или обработка лизоцимом.

Пресс Риби сходен по принципу действия с прессом Френча; различия между ними состоят в том, что пресс Риби развивает большее давление (в нем можно разрушать эндоспоры и некоторые наиболее устойчивые клетки) и имеет систему охлаждения. Его конструкция обеспечивает безопасную работу с патогенными микроорганизмами, однако, к сожалению, этот пресс больше не выпускается.

5.1.2. Разрушение ультразвуком

Для разрушения клеток применяют разнообразные ультразвуковые генераторы с вибрирующим пестиком. Высокочастотная вибрация наконечника пестика вызывает кавитацию, т. е. образование микроскопических пузырьков газа, движущихся с большой скоростью вблизи наконечника. Порождаемые этими быстро движущимися пузырьками большие гидродинамические силы приводят к разрушению клеток. Такой метод разрушения заманчив, так как подобные дезинтеграторы недороги и эффективны. Однако методу ультразвукового разрушения присущи недостатки, ограничивающие его применение в исследованиях, связанных с фракционированием клеточного содержимого.

Основной недостаток заключается в том, что разрушение происходит не мгновенно; для того чтобы разрушилась достаточная доля клеток, клеточную суспензию нужно обрабатывать в течение периода времени от 30 с до нескольких минут. В этот период высвобожденные субклеточные частицы подвергаются тем же самым большим гидродинамическим воздействием, что и неразрушенные клетки. Мембранные пузырьки деградируют до маленьких липопротеидных фрагментов, не осаждающихся при ультрацентрифугировании, а мембранные белки заметно перераспределяются между различными мембранами (например, между внутренней и наружной мембранами у грамотрицательных бактерий).

Во время разрушения клеток ультразвуком довольно трудно поддерживать низкую температуру образца. При этом может происходить вспенивание, вызывающее денатурацию белка, а кроме того, из-за кавитации может ускоряться окисление чувствительных к кислороду ферментов и ненасыщенных липидов. Трудности, связанные с образованием пены и поддержанием нужной температуры, сводятся к минимуму, если пробу подвергать не одной продолжительной, а нескольким кратковременным обработкам и охлаждать в перерывах между обработками. С проблемой окисления можно справиться, если проводить обработку пробы в атмосфере аргона. Нельзя сказать, что рассматриваемый метод отличается хорошей воспроизводимостью, так как эффективность обработки ультразвуком зависит от вязкости пробы, а также от размера, формы и химического состава сосуда, в котором находится проба (например, в стеклянном стакане разрушение клеток проходит гораздо более эффективно, чем в пластмассовом, который поглощает часть энергии ультразвука). Предупреждение: работающие с ультразвуком должны надевать на уши защитные приспособления, если только обработку не проводят в звукопоглощающем боксе.

Ультразвуковая обработка не очень хороша для первичного разрушения клеток, однако она эффективна для лизирования сферопластов (что осуществляется в методике разделения наружной и внутренней мембран грам-отрицательных бактерий по Осборну и Мунсону {8]) как способ разбивания комков из внутриклеточных ор-ганелл и для суспендирования отцентрифугированных осадков. Для этих целей достаточны очень короткие ультразвуковые обработки, в процессе которых внутриклеточные органеллы не повреждаются.

5.1.3. Баллистическое разрушение

Термином «баллистическое разрушение» обозначают разнообразный набор методов, в которых бактерии разрушаются силами сдвига, развивающимися, когда суспензия клеток очень сильно встряхивается или перемешивается вместе с маленькими стеклянными или пластмассовыми шариками. Для этого промышленностью выпускается множество устройств, которые очень детально описаны в обзорах Сэлтона [10] и Хьюджеса с соавторами [4].

В ранних работах широко применялись два устройства— аппарат Микля для встряхивания и аппарат для встряхивания, насаживаемый на ось центрифуги типа International [14]. Ни в одном из них не обеспечивалось поддержание низкой температуры во время встряхивания, и поэтому приходилось часто прерывать процесс для охлаждения пробы. Эти устройства больше не выпускаются промышленностью, они заменены тканевым дезинтегратором Брауна (Braun MSK; В. Braun Melsungen Apparatebau, Melsungen, Federal Republic of Germany), который поставляется в США многими фирмами, специализирующимися на выпуске лабораторного оборудования. Дезинтегратор Брауна имеет контейнер для пробы объемом 65 мл, который качается в горизонтальной плоскости с частотой 2000—4000 колебаний/мин. Охлаждение обеспечивается струей жидкого С02, направляемой к контейнеру с пробой. В большинстве случаев клетки разрушаются за 3—-5 мин при температуре ниже 4°С.

Дезинтегратор Брауна применяют, если требуется выделить клеточные стенки и отдельные ферменты из грамположительных бактерий. Как правило, при этом пользуются методикой Ворка [14].

Суспензию клеток (30 мл с содержанием сухого вещества 20—50 мг/мл) в подходящем буфере смешивают с 20 мл шариков Ballotini № 12 в соответствующем контейнере (для воздуха важно оставить не меньше 20% объема емкости) и в течение 0,5 мин для охлаждения контейнера через аппарат пропускают С02. Затем в течение 3,5—5 мин в зависимости от типа клеток пробу встряхивают с частотой 3000 движений в минуту. Шарики удаляют низкоскоростным центрифугированием или пропусканием смеси через грубый стеклянный фильтр. Некоторые исследователи предпочитают использовать вместо стеклянных шариков пластмассовые, как описано Россом [9], чтобы свести к минимуму денатурацию ферментов. Если описанную выше методику применяют для выделения клеточных стенок, то пробу после встряхивания немедленно подвергают обработке, обеспечивающей инактивацию автолитических ферментов [14].

Эндоспоры бактерий разрушают в дезинтеграторе Брауна при встряхивании сухих спор с сухими шариками (5 г сухих спор плюс 15 г шариков), как описано выше, и затем суспендируют их в буфере, как описано Стейнбергом [12].

5.1.4. Измельчение в твердом состоянии

Клетки можно разрушить размалыванием концентрированной биомассы или лиофилизованных клеток абразивами, такими, как корунд, или измельчением в твердом состоянии, которое достигается при продавливании замороженной суспензии или биомассы через маленькое отверстие или щель. Хьюджес с соавторами [4] дали полное описание этих методов. Промышленностью выпускается аппарат для измельчения замороженной клеточной массы икс-пресс (LKB-Produkter АВ, Bromma, Sweden), в котором эффективно разрушаются как грамположительные, так и грамотрицательные клетки. Однако этот аппарат имеет ограниченную емкость, относительно дорог и сложен в работе. К тому же у него нет особых преимуществ перед прессом Френча или дезинтегратором Брауна.

5.1.5. Обработка мурамидазами

Для приготовления протопластов грамположитель-ных бактерий используют яичный лизоцим. Обычно гидролиз этим ферментом проводят в растворе сахарозы (0,3—0,5 М) при нейтральном или слабощелочном значении рН. Обработка лизоцимом в концентрациях от 0,1 до 1,0 мг/мл в течение 30 мин должна приводить к 100%-ному образованию протопластов. Для контроля этого процесса применяется фазово-контрастная микроскопия. Протопласты стабильны при малых концентрациях Mg2+ и Са2+ (в диапазоне 0,5—5 мМ). Реакцию гидролиза проводят как на холоду, так и при комнатной температуре.

В продаже имеются препараты мурамидаз, имеющих более широкую субстратную специфичность, чем яичный лизоцим; они могут быть очень эффективными при гидролизе клеточной стенки грамположительных бактерий, устойчивых к яичному лизоциму. К этим препаратам относятся лизостафин, мурамидаза из Staphylococcus staphylolyticus (Sigma Chemical Co., St. Louise, МО) и мурамидаза из Chalaropsls sp. (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind.). Работать с этими ферментами следует осмотрительно, поскольку они не так хорошо очищены, как яичный лизоцим, и часто содержат примеси протеаз, липаз или нуклеаз.

В отличие от грамположительных бактерий фактически все грамотрицательные бактерии имеют в своем составе муреин, который чувствителен к лизоциму. Однако наружная мембрана грамотрицательных бактерий непроницаема для лизоцима, и для того чтобы лизоцим подействовал, ее целостность должна быть нарушена. Этого добиваются замораживанием — оттаиванием, предварительной обработкой ЭДТА или в некоторых случаях обработкой антибиотиками, действующими на мембраны, такими, как полимиксин В. Гидролиз муреи-на в грамотрицательных бактериях не приводит к удалению наружной клеточной мембраны, поэтому образующиеся чувствительные к изменению осмотического давления структуры называют не протопластами, а сферо-пластами.

Сферопластьг кишечных бактерий можно приготовить, как описано ниже, по методике Осборна и Мунсо-на ([8]. Культуры центрифугируют и суспендируют в ОД первоначального объема охлажденного 0,75 М раствора сахарозы в 10 мМ трис-ацетатном буфере, рН 7,8. К пробе добавляют лизоцим до конечной концентрации 0,1 мг/мл и инкубируют суспензию на льду в течение 2 мин. Перевод клеток в сферопласты осуществляется в ходе медленного разведения суспензии в течение 8— 10 мин двумя объемами холодного раствора 1,5 мМ ЭДТА, добавляемого посредством перистальтического насоса. Во время разведения суспензию слегка помешивают, а переход в сферопласты контролируют с помощью фазово-контрастной микроскопии.

На образование протопластов и сферопластов от

страница 27
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.09.2017)