Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 5, p. 19— 61. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1975).

78. Frank J. In: J. K. Koehler (ed.), Advanced techniques in biological electron microscopy, p. 217—274. Springer-Vertag, New York, 1973.

79. Hawkes P. W. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 8, p. 262—306. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1978).

80. Horne R. W., Markham R. In: A. M. Glauert (ed.), Practical methods in electron microscopy, vol. 1, p. 327—435. American Elsevier Publishing Co., New York (1972).

81. Markham R., Frey S., Hills G. J. Virology, 20, 88—102 (1963).

82. Peters K-R- In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 7, p. 118—143. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1977).

Флуоресцирующие антитела

83. Goldman M. Fluorescent antibody methods. Academic Press, Inc , New York, 1968.

84. Kawamura A., Jr. Fluorescent antibody techniques and their applications. University Park Press, Baltimore, 1977.

85. Walker P. D., Batty I., Thomson R. O. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5A, p 219— 254. Academic Press, Inc., New York (1971).

Цитохимия

86. Glauert A. M. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy,

2nd ed., p. 274—282. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Иммуноцитохимия

87. Glauert A. M. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy,

2nd ed, p. 292—303. F. A. Davis Lo., Philadelphia, 1965,

88 Hayat M. A. Positive staining for electron microscopy, p. 194—209 Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1975.

89. Kraehenbuhl J. P., Jamieson J. D. Int. Rev. Exp. Pathol., 13, 1—53 (1974).

90. Walker P. D.t Batty I., Thomas R. O. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5A, p. 219—254 Academic Press, Inc., New York (1971).

91. Williams M. A. In: A. M. Glauert (ed.), Practical methods in electron microscopy, vol. 6, p. 1—217. Elsevier/North Holland, Inc., New York (1977).

Радиоавтография

92. Glauert A. M. In: D. Kay (ed), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 282—292. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

93. Satpeter M. M, Bachmann L. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 2, p. 221—279. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1972).

94. Salpeter M. M, McHenry F. A. In: J. K. Koehler (ed.), Advanced techniques in biological electron microscopy, p. 113—152. Springer-Verlag, New York (1972).

95. Williams M. A. In: A. M. Glauert (ed.), Practical methods In electron microscopy, vol. 6, p. 1—217. Elsevier/North Holland, Inc., New York (1977).

Глава 5

ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ

К. Шнайтман

Схемы фракционирования на субклеточном уровне не могут быть универсальными, они обязательно должны быть индивидуальными. В них необходимо учитывать не только особенности отдельных организмов, но и тип органелл, которые выделяют, а также характер информации, которую требуется получить. Мы не будем здесь рассматривать все многочисленные схемы фракционирования, применяемые для бактерий и других микроорганизмов, а опишем лишь некоторые общепринятые методы разрушения клеток и фракционирования их содержимого, используемые для бактерий, и приведем несколько примеров применения этих методов к фракционированию кишечной палочки (Escherichia coll).

5.1. МЕТОДЫ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОК

Выбор метода разрушения клеток является важнейшим моментом при построении схемы клеточного фракционирования. При выборе такого метода необходимо иметь в виду следующее.

1. Соответствует ли метод разрушения клеток типу

исследуемого организма? Единой методики, которая давала бы хорошие результаты для всех типов бактерий,

не существует. Например, один из возможных методов

разрушения большинства грамотрицательных бактерий— продавливание клеток в прессе Френча — не очень

эффективен по отношению к грамположительным коккам. Во встряхивающем гомогенизаторе Брауна полностью разрушаются клетки грамположительных кокков

(Braun MSK shaker) и значительно повреждаются клетки грамотрицательных бактерий.

2, Не повреждаются ли при использовании избранного метода субклеточные органеллы? Такая проблема

существует, например, при работе с ультразвуком. Путем обработки ультразвуком эффективно разрушаются самые различные бактериальные клетки, однако часто при этом повреждаются внутриклеточные органеллы.

3. Имеется ли необходимое оборудование? Многие механические устройства, с помощью которых бактериальные клетки эффективно разрушаются, очень дороги и поэтому малодоступны в обычных условиях или не подходят для обработки требуемого количества материала.

4. Какая методика является самой простой? Методики, в соответствии с которыми необходима длительная инкубация, или методики, включающие много сложных этапов, нередко дают плохой выход или приводят к потере ферментативной активности.

При разрушении клеток любым способом должна контролироваться степень разрушения. Часто с этой целью подсчитывают относительное число выживших клеток, но, видимо, это не лучший способ контроля, так как клетки могут утратить жизнеспособность и без потери внутриклеточного содержимого. Хорошим способом контроля является световая микроскопия влажных препаратов, но только в том случае, если она осуществляется количественно путем подсчета относительного числа оставшихся интактными клеток в счетной камере какого-либо типа. Это необходимо потому, что иногда при разрушении клеток образуются субклеточные фрагменты, которые слишком малы, чтобы их можно было различить в световом микроскопе. Чтобы отличать интакт-ные клетки от лишенных содержимого «теней» или больших фрагментов клеточной оболочки, применяют фазово-контрастную микроскопию, а также негативную окраску нигрозином или тушью. Если клетки разрушают по методике, в соответствии с которой они переходят в сферопласты или протопласты в осмотически стабилизированной среде, важно определить процент такого перехода; при этом лучше воспользоваться счетной камерой, чем просто просматривать влажные препараты. Ли-зированные протопласты или сферопласты часто плохо видны в световой микроскоп, и одного лишь качественного сравнения числа этих структур, оставшихся интактными, с числом нормальных клеток недостаточно.

ЧАСТЬ I. МОРФОЛОГИЯ

Другой эффективный метод контроля заключается в отборе проб по ходу разрушения и их центрифугировании в таком временном и скоростном режиме, который достаточен для осаждения интактных клеток. Надо-садочную жидкость проверяют затем на содержание белка и других поглощающих в ультрафиолете веществ (т, е. нуклеиновых кислот) или специфических цито-плазматических ферментов; таким образом определяют степень выхода этих компонентов из подвергаемых разрушению клеток.

Ниже мы остановимся на нескольких конкретных методиках, которые применяют для разрушения клеток. См. также разд. 18.1.3 и 22.1.

5.1.1. Продавливание с помощью пресса

Продавливание с помощью пресса представляет собой, вероятно, самый распространенный и самый полезный метод разрушения клеток. Некоторое количество бактериальной суспензии (объемом 5—40 мл с содержанием клеток до 30 об. %) помещают в стальной цилиндр с плотно пригнанным поршнем, имеющим маленький выпускной клапан с узким отверстием; с клапаном соединена выводящая трубка. Цилиндр с поршнем ставят под 10-тонный гидравлический пресс. По мере того как поршень опускается, клетки разрушаются большими гидродинамическими силами, возникающими при прохождении клеточной суспензии через отверстие выпускного клапана. У этого метода есть ряд преимуществ. Во-первых, нет проблемы с охлаждением, так как цилиндр и поршень пресса охлаждают заранее, а нагрев происходит только при прохождении клеток через отверстие клапана. Температура вытекающей жидкости повышается на 5—10 °С, но эту жидкость можно быстро охлаждать, если собирать в металлическую пробирку или стакан, помещенные в ледяную баню. Во-вторых, разрушение происходит практически мгновенно, и суспензия разрушенных клеток не подвергается дополнительным гидродинамическим воздействиям, которые могли бы повредить субклеточные частицы. В-третьих, при использовании гидравлического пресса удовлетворительного качества можно проводить эксперименты в хорошо вос

производимых условиях. К тому же на степень разрушения не влияет плотность клеточной суспензии, фаза роста, в которой были собраны клетки, или среда, в которой клетки суспендированы.

Установка типа пресса Френча состоит из цилиндра, поршня, выпускного клапана и подающей нагрузку станины (American Instrument Co. [Aminco], Rockville, MD.). В старых моделях этого пресса использовали быстро изнашивающийся клапан со стальной иглой, который часто повреждался во время работы. Вместо него можно использовать выпускаемый сейчас клапан с подогнанным по размеру нейлоновым шариком (Aminco). Он позволяет поршню доходить до дна цилиндра, не вызывая повреждений, и обеспечивает более однородное разрушение. Удобен также гидравлический пресс с приводом от мотора; пресс можно устанавливать на постоянное усилие в диапазоне скоростей движения поршня (Aminco; или Enerpac, Inc., Butler, Wis.).

Клеточную суспензию загружают в цилиндрическую ячейку и помещают под гидравлический пресс. Поршень пресса опускается на поршень ячейки, пока не разовьется максимальное усилие. До этого момента выпускной клапан закрыт, а затем его медленно открывают до тех пор, пока поршень не пойдет медленно вниз.

Перед разрушением Е. coli клетки собирают, отмывают один раз и суспендируют в объеме буфера [0,01 м HEPES (Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоно-вая кислота), рН 7,4 при 0°С], составляющем 0,1 объема взятой культуры. Добавляют немного панкреатической рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы (0,1 мг/мл) и разрушают суспензию на прессе Френча под давлением 14-107 Па. После разрушения добавляют MgCU до конечной концентрации 1 мМ и удаляют неразру-шившиеся клетки центрифу

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)