Таре) (а, з, о) Предметные стекла Зеростат (г, о) Пастеровские пипетки Ацетат аммония (з, п) Молибдат аммония (з, н, т) Фосфорно-вольфрамовый калий (е, и, к, о, п, т) Уранилацетат (е, з, и, к, п, с,т)

4.6.4. Материалы для фиксации, заливки, приготовления срезов и окраски срезов

Глутаральдегид (е, з, и, к, о, п, т) Na-какодилатный буфер

Может быть куплен как буфер или как набор заранее отмеренных ингредиентов (т). В другом варианте концентрацию какодила-та натрия (е, з, и» к, о, п, т) доводят в воде до 0,2 М, а рН — до 7,2, добавляя НС1. {Предупреждение какодилат токсичен; необходимо избегать контакта с ним и вдыхания содержащих мышьяк паров)

Веронал-ацетатный буфер

Может быть куплен как буфер (к, п) или приготовлен из веронала натрия (п) по следующей прописи для исходного концентрированного раствора:

Веронал натрия (барбитал натрия) 2,94 г

Ацетат натрия, водный 1,94 г

Хлористый натрий 3,4 г

Дистиллированная вода 100 мл

96,5 мл 3,5 мл 1,25 мл

Из этого раствора готовят каждый день рабочий буфер:

Исходный концентрированный раствор 25,0 мл

Дистиллированная вода 1 н. НС1

1 н. СаСЦ (110,98 г/л)

В колбу на 125 мл вливают 25 мл концентрированного раствора. К 90 мл воды в мерном цилиндре на 100 мл добавляют 3,5 мл 1 н. HCI и доливают до 100 мл водой. Этот раствор вливают в колбу с концентрированным раствором, добавляют туда 1,25 мл 1 н. СаСЬ и перемешивают. {Замечание: если клетки, которые должны промываться в этом буфере, до этого подвергались действию фосфатов или в культуральных средах, или в фосфатном буфере, необходимо иметь для начальных промывок рабочий буфер, приготовленный без СаСЬ, чтобы избежать выпадения осадка фосфата кальция. После такой предварительной промывки можно пользоваться полным буфером.)

Защитные очки

Четырехокись осмия (е, з, и, к, о, п, т) Агар марки Noble (в) Уранилацетат (е, з, и, к, о, п, т) Триптон (в)

Триптический соевый бульон (в) Стеклянные кюветы с завинчивающейся крышкой объемом в одну аптекарскую драхму (о, п) Респиратор, Gasfoe (м)

Разовые пластмассовые контейнеры объемом в 4,5 унции (около 130 мл) (а, ж, з)

Среда Спарра:

Поставляется в виде набора (и, к, п) или в виде ингредиентов (т), которые должны использоваться для приготовления исходной смеси, как описано ниже.

Исходная смесь:

ERL-4206 (двуокись винилциклогексана) 30 г или 27,0 мл

DER-736 (диглицидиловый эфир пропилен- 24 г или 22,8 мл

гликоля, эпоксидная смола)

NSA (нонеиилянтарный ангидрид) 78 г или 76,5 мл

Под тягой или надев специальную маску, добавляют все три компонента в указанном выше порядке в разовый контейнер Falcon № 4013 с перемешиванием на магнитной мешалке. В течение 5 мии перемешивают при комнатной температуре. Эту концентрированную смесь без затвердителя можно хранить в плотно закрытом сосуде при —4 °С 3—5 мес. При таком хранении перед открыванием сосуда и после взятия смеси оставшуюся смесь следует выдерживать в течение времени, достаточного для повышения ее температуры до комнатной, чтобы избежать конденсации воды, способной ее испортить.

Полная смесь:

Чтобы приготовить полную смесь, 22 мл концентрированной смеси помещают в разовый контейнер, добавляют 0,24 мл затвердителя S-1 (диметиламиноэтанола) и перемешивают на магнитной мешалке в течение нескольких минут при комнатной температуре. (Для каждого бактериального осадка или другого образца, который должен быть залит, но не для каждого агарового кубика, в который заключен объект, следует использовать по крайней мере 6 мл полной смеси. Этого объема хватит для приготовления нужного количества смесей, применяемых на этапах с 4-го по 6-й при проведении обезвоживания и заливки, а также для заполнения трех капсул Бима. Ясно, что если из каждого образца хотят получить больше чем три блока, нужно взять больше смеси. Аналогичным образом, если работа одновременно ведется более чем с тремя осадками или образцами, начальный объем полной смеси должен быть больше чем 22 мл; последнюю готовят в тех же пропорциях.) Время, в течение которого хранящаяся в контейнере полная смесь может использоваться, составляет всего 2 дня.

Капсулы Бима (каталоговый номер 23200, размер 00) (и, к, о, п, т) Сушильный шкаф

Центрифуга Brinkmann 3200 (Eppendorf). Плоскогубцы

Бритвенные лезвия с одним режущим краем

Ультрамикротом

Стеклянные пластинки

Аппарат для изготовления стеклянных ножей Алмазный нож (д) Зубной воск

Склянки для взвешивания

Пластмассовая чашка для культур тканей, 35Х ХЮ0 мм

Гранулы NaOH

Чашки Петри, стеклянные или пластмассовые Цитрат свинца:

Выпускается готовый к применению препарат (и, к, о, п, т). Может быть также приготовлен по методу Рейнольдса (J. Cell Biol., 17, 208—212, 1963), как описано ниже.

В 50-миллилитровую мерную колбу добавляют:

Нитрат свинца 1,33 г

Цитрат натрия 1,76 г

Дистиллированную воду 30,0 г

Встряхивают в течение 1 мин и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Добавляют 8 мл свежеприготовленного 1 н. NaOH и разводят водой до 50 мл

4.7. ФИРМЫ-ИЗГОТОВИТЕЛИ

а. Curtin-Matheson Scientific, Inc., 10727 Tucker St., Beltsville,

MD 20705

б. Denton Vacuum Inc., Cherry Hill Industrial Center, Cherry Hill,

NJ 08003

в. Difco Laboratories, P. O. Box 1958A, Detroit MI 48232

r. Discwasher, Inc., 1407 N. Providence Rd. Columbia, MO 65201 (or local photo stores)

д. Dupont Instruments, Biomedical Division, Newtown, CT 06470

е. Electron Microscopy Sciences, P. O. Box 251, Fort Washington,

PA 19034

ж. Falcon Labware Division, 1950 Williams Dr., Oxnard CA 93030

з. Fisher Scientific Co., 1 Reagent Lane, P. O. Box 375, Fairlawn,

NJ 07410

и. Ernest F. Fullam, Inc., P. O. Box 444, Schenectady, NY 12301

к. Ladd Research Industries, Inc., P. O. Box 901, Burlington, VT 05401

л. LKB Instruments, Inc., 12221 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852

м. Mine Safety Appliances Co., Pittsburgh, PA 15208

H. Nalge Co., Division of Sybion Corp., Rochester, NY 14602

o. Ted Pella Co., P. O. Box 510, Tustin, CA 92680

n, Polysciences, Inc., Paul Valley Industrial Park, Warrington, PA 18976

p. Sorg Paper Co., Middletown, Ohio 45042

c. SPI Supplies, P. O. Box 342, West Chester, PA 19380

т. Tousimis Research Corp., P. O. Box 2189, Rockville. MD 20852

y. Wheaton Scientific (Vitro), 1000 North 10th St., Millville, NJ 08332

4.8. ЛИТЕРАТУРА

4.8.1. Общая литература

1. Benedetti Ё. L„ Favard P. (ed.). Freeze-etching: techniques and applications. Societe Francaise de Microscopie Electronique, Paris, 1973.

Достаточно полный источник информации по замораживанию — травлению.

2. Dawes С. J. Biological techniques in electron microscopy. Barnes

and Noble, Inc., New York, 1971.

Очень полезная брошюра, в которой содержатся методы, прописи, приложения и литература по общим вопросам.

3. Fuller R., Lovelock D. W. (ed.). Microbial ultrastructure. The use of the electron microscope. Academic Press, Inc., New York, 1976. Включены хорошие примеры результатов применения к микроорганизмам различных методов.

4. Glauert А. М. (ed.). Practical methods in electron microscopy, vol. 1—6. American Elsevier Publishing Co., Inc., New York, 1972. Под этим названием до 1977 г. вышло шесть томов. Каждый из них разделен на части (например, Ультрамикротомия, Методы окрашивания срезов, Радиоавтография и иммуноцитохимия и т. д.). Некоторые из частей выпущены отдельно в бумажных обложках и служат в лабораториях подручным справочным материалом.

5. Goldstein J. I., Yakowitz H. (ed.). Practical scanning electron microscopy. Plenum Press, New York, 1975.

Помимо этого заголовка у сборника есть и подзаголовок — «Электронный и ионный анализ микропроб»; он посвящен в основном физическим и теоретическим вопросам и приложениям к небиологическим объектам.

6. Harris R. J. С. (ed.). The interpretation of ultrastructure. Academic

Press, Inc., New York, 1962.

Содержит некоторые ценные раиние методы.

7. Hayat М. A. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 1—9. Van Nostrand Reinhold Co., New

York, 1970.

Под одним и тем же названием до 1978 г. вышло девять томов, посвященных главным образом трансмиссионной электронной микроскопии. В последние восемь, изданные под редакцией Хэйята, включены главы, написанные другими авторами; они перечислены по отдельности, часть из них полезна для микробиологов.

8. Hayat М. A. Basic electron microscopy techniques. Van Nostrand

Reinhold Co., New York, 1972.

Хорошее описание методов, необходимых для начинающих заниматься электронной микроскопией.

9. Hayat М. A. Positive staining for electron microscopy. Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1975.

10. Hayat M. A. (ed.). Principles and techniques of scanning electron microscopy. Biological applications, vol. 1—6. Van Nostrand Reinhold Co, New York, 1974.

До 1978 г. вышло шесть томов с этим заголовком. Так же как и в предыдущей серии томов по трансмиссионной электронной микроскопии, в главах, составляющих эти тома, рассматриваются частные и узкие области; некоторые из них имеют для микробиолога непосредственное прикладное значение, а все в совокупности ценны для тех, кто пытается расширить свой кругозор в электронной микроскопии. Относящиеся к микробиологии главы отдельно перечисляются в других разделах литературы к данной главе.

11. Kay D. (ed.). Techniques for electron microscopy, 2nd ed. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Книга с тщательным описанием методов, в которой ценно все.

12. Koehler J. К (ed.). Advanced techniques in biological electron microscopy. Springer-Verlag, New York, 1973.

Детально разбирается несколько методов; имеет немалую ценность для того, кто только начинает приобретать опыт.

13. Meek G. A. Practical electron microscopy for biologist, 2nd ed. John

Wiley and Sons, Inc., New York, 1976.

Довольно полно охватывает большинство методов.

14. Welts О. С. Scanning electron microscopy. McGraw-Hill Book Co.,

New York, 1974.

В основном изложена теория вопроса. Только в гл. 12 («Гистологические и цит