Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

обрабатывается и быстро высыхает, а главное ее достоинство состоит в том, что она не нуждается в глянцевании. В больших лабораториях применяют аппараты для автоматизированной обработки, стабилизированную фотобумагу, увеличители с автоматическим контролем контраста и т. п.

Поскольку в разных лабораториях электронные микроскопы, условия съемки, качество пленок и обычные процедуры обработки несколько различаются, мы не будем здесь приводить детальные описания методик Исследователю, осваивающему все это, следует проконсультироваться с опытными исследователями и ознакомиться с приведенными в списке литературы статьями по этому предмету [76—82].

4.4. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Микроскопист должен уметь соотносить увиденное им в электронном микроскопе или на электронных микрофотографиях с тем, что уже известно (или не известно) об анатомии бактерий, т. е. уметь интерпретировать свои результаты. Для этого необходимо иметь некоторые знания в исследуемой области; предполагается, что исследователь, собирающийся изучать бактерии с помощью электронного микроскопа, прослушал курс лекций или читал соответствующую литературу и в общих чертах знаком с ультраструктурой микробов. К сожалению, иллюстрированные атласы, по которым можно легко и быстро сравнивать различные роды и типы микроорганизмов, редки и их трудно найти. К полезным источникам, если только они доступны, относятся атлас, который составили Авакян и др. [53] (текст написан по-русски, а названия бактерий — по-английски), статьи в книге под редакцией Фулера и Ловелока [54, 56, 57, 60, 63], работы Гринхала и Эванса по грибам [55], Лик-фелда по бактериям [61], а также Корменди [66] и Ёшии с соавторами [70] по сканирующей электронной микроскопии в микробиологии. В дополнение или взамен этого обучаемый может положиться на советы наставника в подборе изобилующей ныне литературы по электронной микроскопии бактерий.

В точном смысле слова «интерпретация» может толковаться как извлечение наибольшего количества информации из электронной микрофотографии. Обычно это относится к деталям тонко организованной, периодически повторяющейся структуры, которая присутствует, например, в жгутиках или дополнительных белковых слоях клеточной оболочки. Для квалифицированной работы получение удовлетворительной микрофотографии— только первый этап; она включает также методы увеличения изображения и реконструкции, в том числе обработку с помощью вычислительной техники. Для этих методов требуется сложное оптическое и другое оборудование, доступное не для каждой электронно-микроскопической лаборатории, описание которого выходит за пределы поставленных перед данным руководством целей. Интересующиеся могут обратиться за советом к специалистам или ознакомиться с соответствующей литературой {76—82].

4.5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Предметом специальных исследований является определение сходства или различий бактериальных антигенов, а также их локализации независимо от того, где находятся антигены — внутри или на поверхности клетки. Большое значение имеет также изучение клеточной локализации ферментов и других клеточных компонентов. Для реализации этого полезны методы с применением метки, благодаря которым появляется возможность микроскопически идентифицировать добавленные вещества, выявить их специфическое связывание с другими компонентами или химические взаимодействия. Существует несколько подобных методов, но большинство из них требует слишком много времени, некоторые технически сложны, а некоторые редко дают удовлетворительные результаты. Имея все это в виду, мы не будем здесь подробно останавливаться на этих сложных методах, а ограничимся лишь замечаниями относительно их принципов и ссылками.

4.5.1. Антигены

В наиболее широко используемых методах выявления бактериальных антигенов in situ применяются фракции антисывороток или антител, меченных флуоресцирующими красителями, такими, как флуоресцеин или родамин (разд. 1.4.). Связывание, которое происходит исключительно с поверхностными антигенами интактных бактерий, выявляется с помощью оптической темнополь-ной микроскопии с ультрафиолетовым светом, прошедшим через соответствующие светофильтры, чтобы вызвать характеристическую эмиссию флуорохрома в видимой области. Этот метод очень важен в диагностических и таксономических исследованиях, и поэтому промышленностью выпускается множество меченых антисывороток. По теории и практике этого вопроса опубликовано много трудов [83—85].

Принцип использования флуоресцирующих антител был приспособлен и для электронной микроскопии: антитела или гаптены соединяются с электроноплотными веществами (например, с железосодержащим белком ферритином) или такими, которые могут быть сделаны электроноплотными уже после реакции антиген — антитело (например, с антителом связывается пероксидаза из хрена, которой после связывания дают возможность реагировать с диаминобензидином). На практике используется множество комбинаций, включающих антисыворотки с различными специфичностями, фрагменты антител, гаптены, а также такие маркеры для визуализации, как небольшие вирусы и т. п. Эти методы, применимые к целым бактериям, позволяют локализовать поверхностные антигены точнее, чем это делают с помощью оптического микроскопа. Преимущества электронной микроскопии становятся еще более очевидными, когда меченые антитела применяют еще до фиксации, заливки и приготовления срезов, так что метка видна в тонких срезах. В некоторых случаях аналогичным образом метят не антитела, а другие вещества с известной специфичностью: чаще всего применяются лектины растений, такие, как конканавалин А, которые специфично связываются с сахарными остатками [88].

Выявление внутриклеточных антигенов [89] в интакт-ных бактериях представляет собой более сложную задачу, чем локализация поверхностных антигенов, так как антитела не способны проходить через интактную клеточную оболочку. Поэтому методы решения задач такого рода опираются прежде всего на приготовление тонких срезов бактерий, переносимых затем на поверхность растворов с мечеными антителами, после чего следует промывка, иногда окрашивание и затем исследование с помощью электронного микроскопа. Главная трудность заключается в выборе среды для заливки, которая должна давать доступ для связывания антителам в водном растворе. В этих целях испробовано много различных веществ (метакрилаты, сшитый альбумин, различные протравленные пластмассы и эпоксидные смолы), но ни одно из них не может считаться удовлетворительным во всех отношениях; в этой области необходимы дальнейшие исследования. Интересующиеся могут получить общее представление о методах и проблемах имму-ноцитохимии или иммуноэлектронной микроскопии, изучив предлагаемую литературу [87—91].

4.5.2. Ферменты

Проблема точной локализации ферментативных активностей в той форме, в какой они реализуются в клетке, давно стоит на повестке дня в гистохимии, а ныне — в цитохимии на уровне электронной микроскопии. Для ферментов разных типов используются различные методы. Это зависит от того, насколько возможно применение искусственных или меченых субстратов, которые в нормальных условиях транспортируются в клетку и вступают в реакцию, образуя продукт, видимый либо в световой, либо в электронный микроскоп. Изучению ферментативных активностей посвящена обширная литература, на которой мы не можем останавливаться из-за ограниченного объема настоящего руководства. Необходимую информацию читатель найдет в многочисленных работах, которые публикуются в журналах, посвященных исключительно гистохимии и цитохимии [86].

4.5.3. Радиоавтография

Другая большая область знаний, исследования в которой, подобно использованию меченых антител в гистохимии, перешли с оптического на электронно-микроскопический уровень, посвящена изучению поведения внутри клетки веществ, меченных радиоактивными атомами, их распределению и локализации. Радиоактивная техника применима к широкому кругу проблем, но в случае бактерий (из-за их малого размера) необходимо особое внимание к условиям опыта и качеству эмульсии, которая должна обеспечивать минимальную зернистость. Принципы и методы техники с применением радиоактивных веществ достаточно полно описаны в ряде книг [92—95].

4.6. МАТЕРИАЛЫ

Поставщики перечисленных ниже материалов обозначены буквами (в скобках) в соответствии со списком, представленным в разд. 4.7.

4.6.1. Материалы для приготовления пленок-подложек

Формвар, порошок (и, к, о, т) Растворы формвара (и, к, т) Дихлорэтан (з, и, к, о, п, т) Чистые микроскопические стекла Неволокнистый протирочный материал (и, к, о, р,) Большие металлические (или пластмассовые) лотки или кюветы

Большая стеклянная чашка с вертикальными стенками. Оптимальные размеры 200X80 мм (культураль-ная чашка Vitro; о, у). Крышка должна быть ровной и гладкой. Дно и стенки постоянно покрыты черной изолентой, чтобы легче было видеть плавающие пленки на черном фоне

Черная изоляционная лента

Стеклянная палочка, длина которой больше диаметра чашки

Стеклянные кюветы Коплина для окрашивания (а, з, о, у)

Пастеровские пипетки и резиновые груши 10%-ная плавиковая кислота в тефлоновом контейнере (з)

Бритвенные лезвия, отмытые спиртом Фильтровальная бумага (Whatman № 1), кружки диаметром 9,0 см (а, з)

Стандартные чашки Петри диаметром 9,0 см Ножницы

Пинцет для сеток Dumont № 5 или эквивалентный ему (и, к, о, п, с, т). (Вокруг основания пинцета можно сделать одну-две петельки из нихромовой проволоки, которые продвигаются вперед для смыкания кончиков пинцета на сетке, что помогает предотвратить случайное выпадение сеток. Если такие петельки сделаны, нет необходимости покупать дорогостоящий пинцет, имеющий специальную конструкцию для захвата сеток.)

Медные сетки, предварительно очищенные (е, и, к, л, о, п, с, т)

Люминесцентная лампа

4.6.2. Материалы для приготовления углеродных пленок

Высоковакуумные испарители и дополнительные принадлежности (б, и, к)

4.6.3. Материалы для негативного контрастирования

Сетки с подложкой, приготовленные, как описано, или купленные (и, к, т)

Липкая лента (Time

страница 23
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)