Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

ни и геометрических расчетов, опирающихся на известный угол оттенения. Измерению помогает нанесение на сетку в целях калибровки стандартного объекта, такого, например, как латексные шарики известного размера. Оттенение проводится следующим образом.

1. Исследуемый образец, не содержащий внешних загрязнений, предварительно фиксируют, но это не обязательно.

2. Образец помещают на покрытую формваром сетку и подсушивают. Сетку прикрепляют к липкой с обеих сторон ленте, находящейся на предметном стекле, вместе с маленьким кусочком тонкой фильтровальной бумаги, служащим визуальным индикатором количества напыленного при испарении металла. (На части кусочка бумаги делают складки, чтобы иметь для сравнения напыленные и ненапыленные стороны.)

3. Предметное стекло помещают в напылительную установку на столик для образцов. (Мы применяем вращающийся столик Fullam № 1205 в испарителе модели Varion VE 10, снабженном охлаждаемой жидким азотом ловушкой для увеличения вакуумного разрежения. В каждой лаборатории имеются свои приборы и приемы изменения угла оттенения между сеткой с образцом и нитью металла.)

4. Платино-палладиевую проволоку закручивают вокруг удерживаемой между электродами вольфрамовой нити (Fullam № 1623), сделанной из стандартной вольфрамовой проволоки диаметром 0,7 мм. Платино-палла-диевая проволока длиной 1 мм содержит 80% платины и 20% палладия (Fullam № 1221). Перед ее закручиванием сначала разогревают в вакууме вольфрамовую нить до белого каления и только после этого открывают испаритель и укрепляют платино-палладиевую проволоку. (При этом происходит дегазация вольфрамовой нити, что улучшает вакуум во время последующего испарения металла и снижает напряжения, возникающие в проволоке при ее изгибе; это способствует увеличению срока службы нити.)

5. Источник металла — обмотанную вокруг вершины V-образной вольфрамовой нити платино-палладиевую проволоку — располагают примерно в 12 см над сетками под желаемым углом. После того как в испарителе устанавливается хороший вакуум (10~5 мм рт. ст.), включают быстрый нагрев металла до точки плавления. В таком состоянии система находится до тех пор, пока не испарится весь металл или пока напыление на видимой глазом индикаторной фильтровальной бумаге не покажется достаточным. Чтобы судить об этом, требуются некоторый навык и опыт.

6. Иногда, чтобы получить минимальный фон и меньшую по сравнению с платинопалладиевым сплавом зернистость, полезно применять напыление окисью вольфрама. Для этого V-образную вольфрамовую нить нагревают на воздухе, пока она не покроется желтой окисью вольфрама (WO2). Кристаллы окиси вольфрама счищают скальпелем, оставляя их лишь на вершине V-образ-ной нити; нить помещают в испаритель между электродами и далее проводят оттенение, как описано выше.

4.1.5. Получение реплик [44, 45]

Реплики представляют собой слепки (отпечатки), которые ввиду их непрочности и прозрачности для электронов не подходят для прямого микроскопирования и должны напыляться металлом. Тонкие пленки материалов, прозрачных по отношению к электронам (обычно коллодия, формвара или поливинилового спирта), находясь в контакте с изучаемыми поверхностями и структурами, образуют слепок, тем самым как бы очерчивая их. Реплики, в которых в процессе отслаивания от поверхности-оригинала и перехода пленки в плавающее состояние оказались захваченными некоторые частицы, считают ложными.

Получение реплик существенно для анализа поверхностей методом замораживания — скалывания и замораживания— травления. Обычно реплики готовят (с применением платино-углеродного напыления) на сколотых образцах, содержащихся при—100 °С. Техника замораживания—скалывания играет важную роль при исследовании внутренней структуры клеточной мембраны, а также образцов, которые не фиксировались и не изменялись путем химических воздействий. Однако для ее применения необходимо специальное оборудование и соответствующий опыт в работе. Описание конкретных методов получения реплик выходит за рамки настоящего руководства [46—48].

4.1.6. Нуклеиновые кислоты

С тех пор как вышла работа Кляйншмидта и Цана [74], нанесение отдельных молекул нуклеиновых кислот на белковый или другой монослой с последующим контрастированием ураном и оттенением вращающегося образца с целью микроскопирования стало широко распространенным приемом, претерпевшим некоторые модификации. Метод Кляйншмидта и Цана, чрезвычайно важный в молекулярной микробиологии и генетике микроорганизмов, хорошо описан в соответствующих работах /[71—73, 75] и во многих специальных публикациях. Определение гомологии молекул плазмидных ДНК можно найти в разд. 15.3.5.

4.2. СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Характерные черты и преимущества сканирующей электронной микроскопии отмечались выше, в вводном разделе. Для бактериолога ценность микроскопии этого вида заключается в том, что с ее помощью можно получать трехмерное изображение микроорганизмов, различать детали строения поверхностей (в пределах разрешения) и выявлять пространственные взаимосвязи бактерий, растущих в виде разнообразных ансамблей. Приготовление образцов включает в себя фиксацию находящегося на поверхности (например, на покровном стекле) материала, закрепление в держателе (этого этапа может не быть), иногда промывку и другие обработки, высушивание до критической точки или другими способами и обычно — напыление золотом или еще каким-либо тяжелым металлом в вакууме перед микро-скопированием. На эти процедуры уходит довольно много времени, и для их выполнения нужны специальные навыки. Если учесть также недоступность сканирующего электронного микроскопа для многих лабораторий, то станет ясно, что исследователю, изучающему бактериальные структуры, по-видимому, не стоит начинать микроскопический анализ со сканирования — легче и быстрее достаточно детальную информацию можно получить с помощью негативного контрастирования. Для тех, кто имеет все необходимое и интересуется применением сканирующей электронной микроскопии для решения отдельных проблем, предлагаются многочисленные литературные источники [49—52, 64—70].

4.3. ФОТОГРАФИЯ

Электронные микрофотографии являются итогом, отражающим деятельность микроскописта, поэтому правильная съемка и обработка фотографий представляют собой существенные этапы исследования. Большинство микроскопов приспособлены для съемок на фотопластины, рулонную пленку или и на то, и на другое. Рулонная пленка (35 мм) дешева и ее легко хранить. Стеклянные фотопластины легко бьются, тяжелы и требуют множества дорогих приспособлений для хранения. В настоящее время стеклянные пластины в основном заменены на покрытые эмульсией пленки, сделанные на основе эстара, которые устойчивы к изменению размеров и удобны для хранения.

Основная трудность, связанная с работой с фотопленками, заключается в том, что как эмульсия, так и основа поглощают водяные пары. Поэтому предусмотрительный микроскопист хранит их покрытыми светонепроницаемыми пластинами вместе с набором алюмоосушите-лей. Пластины делают из листа алюминия, идущего на изготовление заслонки перед игольчатым вакуумным клапаном. Пленку, отрезанную на нужную длину, или отстоящие друг от друга стопки нарезанной пленки помещают для высушивания на подложку в виде сетки. На дно сосуда, находящегося в темной комнате, ставят поддон с пятиокисью фосфора, которую перемешивают при каждом его открывании и в случае необходимости заменяют. Умеренное разрежение и химический осушитель способствуют хранению пленки в сухом виде. Благодаря наличию предварительного вакуума устраняется необходимость продолжительной работы вакуумного насоса в электронном микроскопе. В некоторых микроскопах осушители встроены, но они редко удовлетворяют рекомендованным выше условиям хранения.

По нашему опыту для обычных целей лучше всего подходит мелкозернистая позитивная пленка (Kodak;

35 мм), если только микроскоп приспособлен для работы с ней. Для камер с фотопластинами мы применяем Kodak Electron Image film № 4489 —пленку в виде листов, сделанную на основе эстара, которая имеет превосходную стабильность размеров и устойчива к разрыву. Она заменяет стеклянные пластины и сходную по свойствам пленку (№ 4463), не поступающую больше в продажу. За более подробными инструкциями следует обратиться к проспекту Kodak Data Release, с. 198, выпущенному вновь в феврале 1980 г., в котором описаны характеристики этой пленки и способы ее проявления. Это вполне естественно, что в любом случае прежде всего необходимо познакомиться с данными и рекомендациями, предоставляемыми фирмой-изготовителем. Затем с опытом придет уменение устанавливать выдержку, проявлять и добиваться на негативе желаемого контраста.

Умение фокусировать и получать резкие негативы приходит с опытом, но полезно напомнить, что при больших увеличениях точно установленный фокус не обязательно является лучшим для печатания негатива. Поэтому неплохо иметь привычку делать 3—5 «околофокусных» снимков для каждого нужного поля зрения, пытаясь получить истинный фокус в положении, немного отклоняющемся от среднего. Смещение при каждом шаге меняется от 0,05 мкм (при увеличении на пленке 30 000Х) до 0,4 мкм (при увеличении на пленке 4000Х)При печатании электронных микрофотографий требуется особое внимание к мельчайшим деталям. Очень важно пользоваться высококачественным увеличителем. Имейте в виду, что увеличители с конденсорами, работающими от точечного источника, передадут каждую царапину, имеющуюся на неэмульсионной стороне пленки. Для воспроизводимости полезны автоматические экспонометры, калибруемые для каждого типа применяемой фотобумаги один раз (например, Lectra РТМ-4А Densi-thner). Следует иметь широкий выбор фотобумаги, поскольку неизбежна некоторая разница в негативах. Этому удовлетворяет система множественной градации фотобумаги с применением соответствующих светофильтров или набора бромированных типов бумаги с номерами контрастности от 2 до 6. В последнее время участилась практика поставки бумаги с эмульсией, покрытой специальной смолой (обозначается RC — от англ. resin-coated). Такая бумага быстро

страница 22
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.11.2017)