Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

зают блок со всех четырех сторон под углом 30° (угол пирамиды у блока, находящегося в капсуле, равен 60°), продвигаясь по направлению вниз от образовавшейся площадки; в результате остается маленькая усеченная пирамида (верхняя поверхность — квадрат со стороной ~1 мм), из которой готовят срезы. Тщательно работающий исследователь, обладающий определенным навыком, быстро выучивается получать хорошие блоки, срезаемая поверхность которых имеет трапециевидную форму. Однако лезвие бритвы обязательно оставляет после себя относительно крупные бороздки, которые идут под прямым углом к верхней площадке усеченной пирамиды; в связи с этим при прохождении среза на поверхность может выступать вода, мешающая получению хороших результатов. Мы предпочитаем делать дальнейшую тонкую доводку поверхности, по которой пойдет срез, и боковых граней пирамиды микротомом; при этом любые неровности на гранях располагаются параллельно краям верхней поверхности блока. Тонкая доводка при помощи микротома описана в литературе |[42].

Приготовление срезов

Поскольку в каждой лаборатории существуют свои методики и свои способы работы на микротомах, мы не будем описывать здесь сам процесс нарезания. Описание методов, приемов работы на микротомах и скрытых трудностей, с которыми при этом сталкиваются, подробно изложено во многих работах и руководствах по электронной микроскопии, а также в проспектах и инструкциях, выпускаемых изготовителями микроскопов [39, 40, 42]. Помимо этого, некоторые фирмы (например, LKB Instruments) проводят семинары или организуют в соответствии с поступившими запросами краткие курсы обучения по работе на ультрамикротомах. Мы полагаем, что исследователь, изучающий анатомию бактерий, имеет возможность обратиться за помощью к специалисту по ультрамикротомии, который способен проинструктировать его или в крайнем случае довести до нужного качества срезы, уже заключенные на сетках и готовые к окраске.

Ножи

Для приготовления ультратонких срезов применяются как стеклянные, так и алмазные ножи. Стеклянные ножи, которые, безусловно, дешевле, готовятся вручную или (с большей точностью и в больших количествах) при помощи аппарата, делающего ножи, такого, например, как LKB 7800 Knife Maker. Производство стеклянных ножей описано в литературе [34—40, 42] и в сопроводительных руководствах к соответствующим аппаратам. Стеклянные ножи используются лишь для подготовки верхней и боковых поверхностей блоков. Выбор ножа для приготовления срезов зависит от финансовых возможностей, вкусов и опыта исследователя, а также от применяемого для заливки полимера. В некоторых случаях предпочитают стеклянные ножи, использование которых дает прекрасные результаты. Использование алмазного ножа дает более воспроизводимые результаты, по мере того как оператор привыкает к его режущим и другим свойствам при постоянном применении стандартной заливки. Требования к углу лезвия могут различаться в зависимости от типа заливки, так что необходимая величина угла должна оговариваться при закупке алмазных ножей. В случае самых общепринятых сред для заливки бактериальных препаратов (эпон, мараглас, аралдит), а также для несколько более мягкой среды Спарра, которую мы используем чаще всего, вполне подходит величина угла от 42 до 45°. При заливке этими средами, тщательном исполнении всех операций и соблюдении предосторожностей в работе можно использовать один алмазный нож хорошего качества в течение 5 лет и более. Естественно, срок службы ножа зависит также от количества производимых с его помощью срезов.

Окраска уранилацетатом

Поскольку по описанной методике материал, находящийся в блоке, окрашивается еще до заливки, окраска срезов уранилацетатом обычно не требуется. Если хотят дополнительно усилить контраст или если находящийся в блоке материал не окрашен, то поступают следующим образом.

1. Наполняют соответствующее количество крышек от капсул Бима размером 00 1%-ным уранилацетатом, приготовленным либо на воде, либо на 70%-ном этаноле, до появления положительного мениска. (Если растворы водные, то капли можно наносить на пластинку чистого зубного воска.)

2. Каждую сетку со срезом, обращенным вниз, опускают на поверхность красителя, так чтобы она держалась на плаву. Пастеровской пипеткой осторожно отсасывают небольшое количество жидкости, добиваясь центрального расположения сеток в крышке.

3. Сетки накрывают крышкой от чашки Петри и пробы оставляют окрашиваться на 30 мин,

U4

4. Крышки поднимают, сетки берут пинцетом, погружают для промывки три раза в дистиллированную воду и высушивают на фильтровальной бумаге.

Окрашивание цитратом свинца

Некоторые экспериментаторы в своих целях используют окраску только уранилацетатом, но иногда получаемый при этом контраст бывает относительно слабым, а увеличение длительности окрашивания приводит к нежелательной зернистости. Для придания дополнительного контраста и для окрашивания некоторых компонентов, слабо проявляющихся за счет одного лишь урана, применяют обычно цитрат свинца (разд. 4.6.4). Его удобно хранить, а при разливке пластмассовым шприцем легко исключить контакт этого реактива с воздухом. В нашей лаборатории принята следующая схема его использования.

1. Окрашивание проводят в стеклянной чашке Петри, дно которой покрыто застывшим зубным воском. Пластмассовым чашкам восковое покрытие не требуется, так как единственная преследуемая при этом цель — получить выпуклые, изолированные друг от друга капли красителя.

2. Три маленькие склянки для взвешивания наполняют бидистиллированной или деионизованной водой и в дальнейшем используют их для промывки.

3. В камеру для окрашивания ставят пластмассовую чашку для культур тканей с размерами 35X100 мм на диске из фильтровальной бумаги, имеющем немного большие размеры. Чашку наполняют гранулами NaOH, а бумагу смачивают 0,02 н. NaOH.

4. Наносят несколько капель раствора цитрата свинца на восковую или пластмассовую поверхность. Немедленно накрывают все крышкой от чашки Петри, чтобы избежать образования нерастворимого карбоната свинца за счет взаимодествия с СОг воздуха. Присутствие в чашке NaOH также предотвращает появление нерастворимого карбоната свинца, так как щелочь поглощает С02 с образованием углекислого натрия.

5. Когда все готово, поднимают крышку и на каждую округлую каплю кладут в перевернутом виде сетки поверхностью среза вниз. Камеру быстро закрывают крышкой и оставляют для прокрашивания на 3—5 мин (оптимальное время определяют экспериментально).

6. Сетку вынимают пинцетом и быстро погружают по пять раз подряд в каждую промывную склянку с водой. Для удаления воды прикасаются краем сетки к фильтровальной бумаге и оставляют на ней сетки для просушивания.

Замечание: по неизвестным причинам кратковременная обработка уранилацетатом, за которой следует обработка цитратом свинца, приводит к более интенсивному включению свинца.

4.1.3. Прямая микроскопия

Бактериальные препараты можно прямо исследовать с помощью трансмиссионного электронного микроскопа; при этом, однако, экспериментатор лишается тех преимуществ по усилению контраста, которые дают негативные красители. Исследуемые микроорганизмы можно вырастить на формваровой или коллодиевой подложке или поместить их на эти подложки и просматривать на любой стадии роста. Однако и в этом случае исследователь получит очень ограниченную информацию, за исключением опытов, когда интересуются электроно-плотным материалом, присущим самому образцу. Вместе с тем негативно контрастированные образцы позволяют получать гораздо большую информацию о структуре, тогда как время, затрачиваемое на негативное контрастирование, совершенно незначительно.

К другим методам прямого исследования относятся имеющие высокое разрешение темнопольная электронная микроскопия и электронно-оптическая фазовая микроскопия. Эти методы не имеют большого значения для исследователей, начинающих изучать структуру бактерий, так как, чтобы их применять, нужны специальные микроскопы и особая обработка образцов. Специальным методом является также высоковольтная электронная микроскопия, которая, помимо того, что она дает высокое разрешение, позволяет исследовать образцы с большой толщиной без излишнего повреждения электронным

пучком. (Интересующихся отсылаем к цитируемой литературе, в особенности к многотомнику [7], т. 3, гл. 3 и 4.)

4.1.4. Оттенение металлами [44, 45]

Из-за растущей популярности и доступности сканирующих электронных микроскопов использование отте-нения металлами сокращается. Однако, подобно сканирующему микроскопу, этот метод позволяет получать детальные изображения поверхностных структур и определять размеры бактерий, что может оказаться полезным ввиду большей разрешающей способности трансмиссионного электронного микроскопа; им можно легко воспользоваться в отсутствие сканирующего электронного микроскопа.

Тень формируется в результате отложения под определенным углом электроноплотного материала на образце во время пребывания в вакуумном испарителе. Те области, которые расположены под углом к направлению напыления металла, остаются не покрытыми им и, будучи менее электроноплотными, пропускают электроны. В результате электроны как бы очерчивают эти области, которые на обработанном негативе видны в виде черных теней. Поскольку выглядит это, как позитивное изображение, обычно (хотя и не всегда) негативы обращают контактным способом и для воспроизведения позитивного изображения окончательные фотографические отпечатки получают с обращенных негативов. (Техника оттенения хорошо описана в гл. 5 [11] и в гл. 4 и 5 т. 2 многотомника [7].) Прямое отгенение испаряющимися металлами применяется но отношению к целым клеткам или их компонентам, бактериофагам или различным суспензиям; этот метод используется также для анализа реплик, приготовленных из интактных препаратов или при замораживании—скалывании и замораживании—травлении (см. ниже). Помимо очерчивания поверхностных неровностей и периодически повторяющихся структур, техника оттенения может применяться для измерения высоты образца по вертикали посредством нахождения длины те

страница 21
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.10.2017)