Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

мов, подтвердить наличие жгутиков (вероятно, уже предполагавшееся при изучении подвижности) и выявить их расположение и тонкую структуру. Можно детализировать другие поверхностные отростки, такие, как ворсинки и фимбрии, или убедиться в присутствии слоя слизи или вещества капсулы. Выявляются также различия между прокариотами, окруженными мембраной, но лишенными клеточной стенки (микоплазмы или L-формы бактерий), и прокариотами, имеющими клеточную стенку.

Природу клеточной оболочки определяют путем разрушения клеток и фракционирования клеточных структур, благодаря чему появляется возможность ясно различить упорядоченную тонкую структуру слоев клеточной стенки. Этот прием позволяет разделить и сделать видимыми такие компоненты, как мембраны, мезосомы, другие цитоплазматические мембранные системы, газовые вакуоли, метаболические гранулы, рибосомы, жгутики, ворсинки и т. д. (Гидродинамические силы, возникающие при отборе раствора шприцем или при чрезмерно интенсивном пропускании его через пипетку, могут привести к отрыву жгутиков и ворсинок от клеточной поверхности.) Краситель проникает в периплазма-тическое пространство между мембраной и клеточной стенкой, и, благодаря тому что он заполняет все образуемые мембраной углубления, выявляются очертания мезосом. Это в свою очередь позволяет быстро (и обычно точно) определить, какую бактерию изучают — грам-отрицательную или грамположительную.

Негативное контрастирование представляет собой также удобный способ наблюдения за деградацией клеток при их постепенном разрушении и за изменениями, вызываемыми обработкой такими агентами, как ферменты, антибиотики, поверхностно-активные вещества и т. д.

Используемый непосредственно, а лучше после индукции, метод негативного контрастирования незаменим при быстром обнаружении лизогенного состояния путем нахождения бактериофагов или еще не собранных их компонентов, что имеет большое значение при изучении ультраструктуры и стадий развития вирусов, а также взаимодействий вируса с клеткой-хозяином.

Результаты негативного контрастирования и других способов анализа с помощью трансмиссионной электронной микроскопии можно найти в работах, список которых приведен в конце главы [53—63].

4.1.2. Приготоиление срезов [34—43]

Прокариотические клетки, которые собираются анализировать с помощью срезов, должны быть химически фиксированы, промыты и обезвожены для заливки в материал, способный прочно затвердевать. После заливки можно нарезать очень тонкие срезы, затем обработать препарат растворами солей тяжелых металлов и исследовать в электронном микроскопе. Хотя применяются многие различные комбинации, мы считаем, что в целом достаточно использовать фиксацию в глута-ральдегиде и четырехокиси осмия или только в четы-рехокиси осмия с последующей заливкой в среду Спар-ра [43]. Имеется целый набор пластических материалов для заливки, но для обычных целей вполне подходит среда Спарра.

О с мий-глутар альдегидная фиксация

1. К клеточной суспензии или жидкой культуре добавляют равный объем 5%-ного глутаральдегида в 0,2 М Na-какодилатном буфере, рН 7,4 (конечная концентрация глутаральдегида 2,5%). В другом варианте клетки центрифугируют и суспендируют осадок в 2,5%-ном глутаральдегиде в какодилате. (Какодилат токсичен; поставщики и прописи для этих и других веществ приводятся в разд. 4.6 и 4.7.) Перед этим этапом проводят отмывку в свежей среде или соответствующем буфере. Для некоторых прокариот, особенно некоторых микоплазм, лучше отказаться от какодилата и готовить глу-таральдегид в разных концентрациях на свежей куль-туральной среде, чтобы сбалансировать осмотические свойства и (или) рН.

2. Пробы фиксируют 2—3 ч при комнатной температуре. В действительности время можно варьировать: обычно достаточно любого интервала больше 20 мин. (Мы с успехом подвергали обработке бактерии, путешествовавшие через всю страну в глутаральдегиде в течение нескольких дней.)

3. Осадок дважды промывают в веронал-ацетатном буфере Келенбергера с помощью центрифугирования.

4. Промытый осадок суспендируют в 1%-ной четы-рехокиси осмия и оставляют на 6—16 ч при комнатной температуре. (Фиксированный глутаральдегидом осадок перед проведением этого этапа можно заключить в агар: см. этапы 6—8.) Предупреждение: работать с летучими и токсичными фиксаторами и другими веществами следует под тягой или по крайней мере надев очки и респиратор, чтобы защитить эпителий роговицы и дыхательных путей. Если чувствуется запах четырехокиси осмия, глаза могут подвергнуться опасному воздействию паров. Для того чтобы исключить возможность повреждений, в лаборатории в определенном месте должен находиться комплект для промывки глаз [Nalge Со], используемый в случае необходимости.

5. Центрифугируют и промывают почерневший осадок, вновь суспендируют его в веронал-ацетатном буфере и еще раз центрифугируют.

6. Готовят 2%-ный агар марки «Noble» на веронал-ацетатном буфере и охлаждают его до 45 °С. Добавляют к осадку 2—3 капли этого агара и быстро перемешивают при помощи теплой пастеровской пипетки.

7. Этой же пипеткой суспензию быстро разливают по очищенному спиртом предметному стеклу и дают агару застыть. Бактерии должны находиться в достаточной концентрации и быть равномерно распределенными. Чистым бритвенным лезвием из застывшего агара нарезают кубики с ребром 1 мм.

8. Кубики суспендируют в 0,5%-ном водном урани-лацетате и оставляют при 4°С на 16 ч. [Раствор урани-лацетата нужно профильтровать (фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, Millipore Corp.), чтобы предотвратить кристаллизацию при этой температуре.]

Осмиевая фиксация

1. Центрифугируют клеточную суспензию или культуру.

2. Осадок промывают, суспендируют его в свежей культуральной среде или веронал-ацетатном буфере, центрифугируют и суспендируют в среде с триптоном или в триптическом соевом бульоне. (Применять эти растворы не обязательно, но обычно они улучшают выявление рибосом и нуклеоидов [58, 59, 62].)

3. Взвесь центрифугируют и суспендируют осадок в 0,1%-ной четырехокиси осмия, приготовленной на веронал-ацетатном буфере. Фиксацию проводят в течение 2—4 ч при комнатной температуре.

4. Дальше поступают так же, как на описанных выше этапах, с 3-го по 8-й.

Обезвоживание и заливка средой Спарра

1. Обработанные уранилацетатом агаровые кубики дважды помещают для промывки в 70%-ный этанол, каждый раз на 15 мин. Делают это в кювете на 4,5 мл (одна аптекарская драхма), используя 2—3 мл этанола.

2. Последовательно промывают пробы в 80%-ном и 95%-ном этаноле, по 15 мин в каждом.

3. Пробы помещают в 100%-ный этанол на 30 мин.

4. Этанол сливают и к пробам вновь добавляют 1 мл свежего 100%-ного этанола. Затем вносят 1 мл полной среды Спарра и смесь тщательно, но осторожно перемешивают. В этих условиях пробы оставляют на 30 мин, время от времени перемешивая, или до тех пор, пока кубики не осядут на дно кюветы (среду легче всего удалять, применяя разовые пластмассовые шприцы.)

5. Добавляют 1 мл среды Спарра и повторяют операцию.

6. Заменяют среду на новую (2,0 мл) и оставляют на 1—2 ч, пока кубики не осядут на дно.

7. В капсулы Бима размером 00 вкладывают типовые метки (в соответствующем держателе) и заливают в каждую один и тот же объем полной среды Спарра. (Мы заливаем 0,55 мл, чтобы окончательно получающийся блок точно входил в зажим микротома фирмы LKB.)

8. При помощи заостренной деревянной палочки в каждую заполненную капсулу помещают по одному пропитанному кубику (6-й этап) . Кубик должен опуститься на дно капсулы через 1 мин.

9. Капсулы со снятыми крышками (чтобы обеспечить улетучивание остатков любого растворителя) помещают в сушильный шкаф при 70 °С на 16 ч для полимеризации. Сразу после вынимания из шкафа блоки, образовавшиеся в капсулах, могут показаться слегка мягкими, но они приобретут оптимальную для резки твердость через 2—4 ч при комнатной температуре.

Другие фиксаторы и среды для заливки

Для специальных целей разработано много разных фиксаторов, применяемых в различных комбинациях и разной последовательности. К ним относятся перманга-наты и различные альдегиды, принципы использования которых, включая эффекты, зависящие от рН, буферов, ионной силы, концентрации, температуры и длительно-си фиксации, обсуждаются в многочисленных книгах [34—39]. Для заливки применяют очень много сред [34—39] по отдельности или в смесях, причем выбор среды отчасти зависит от того, какая из них доступна. Чаще всего, вероятно, применяется эпон 812 (хотя есть сведения, что он вскоре не будет поставляться производящей его фирмой, а будет заменен подобными средами, выпускаемыми другими фирмами). Для заливки используются также дуркупан, аралдит, мараглас, весто-пал, для специальных целей различные метакрилаты и множество эпоксидных смол. Подробное описание свойств этих сред и советы по их применению читатель найдет в соответствующей литературе. Мы остановились здесь на детальном описании единственной методики, которая является наиболее удовлетворительной.

Подготовка блоков

Перед тем как делать срезы, застывшие блоки, находящиеся в капсулах Бима или в капсулах других типов, следует вынуть и довести до подходящих размеров и формы. Заливать можно в плоские желатиновые капсулы или в специальные плоские формы, и в соответствии с этим существуют различные методы подготовки блоков [42]. Новейшие модели микротомов часто содержат устройства для подготовки блоков; такие устройства выпускаются также отдельно. Методика подготовки блоков заключается в следующем.

1. Капсулу обжимают со всех сторон плоскогубцами, чтобы блок не очень плотно прилегал к ее стенкам. Затем сжимают вершину пирамиды капсулы и продвигают блок до полного высвобождения. (Блоки можно также высвобождать с помощью продольных бритвенных разрезов капсулы с двух сторон.) Блок закрепляют в держателе вершиной пирамиды вверх и помещают держатель в зажим микротома.

2. Глядя в бинокулярный микроскоп, подрезают очищенной этанолом бритвой верхушку пирамиды блока (по которой будет проходить срез после установки в ультрамикротоме), чтобы он смог войти в ячейку. Обре

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)