ть природное состояние бактерий и их пространственные взаимосвязи, не нарушенные набиранием в пипетку или другими процедурами, для которых характерны сдвиговые усилия. Подобные процедуры могут вызвать отрыв жгутиков, ворсинок или других хрупких структур. Описанный способ полезен также для быстрого определения морфологического типа фага, вызвавшего образование стерильного пятна на газоне индикаторной культуры бактерий.

Отмывка

Отмывка сетки — полезная дополнительная процедура, следующая за нанесением суспензии, но предшествующая негативному контрастированию (в двухэтапном методе). Ее проводят для того, чтобы удалить остатки клеток, а также излишки солей и белка, выпадающие в осадок под действием некоторых красителей и ухудшающие изображение исследуемых компонентов. Отмывку проводят, быстро прикасаясь поверхностью сетки к капле воды, причем эту операцию повторяют несколько раз с новыми каплями дистиллированной воды или еще какой-либо жидкости. Другой способ отмывки заключается в том, что сетку препаратом вниз помещают на влажную поверхность полоски тонкой согнутой фильтровальной бумаги ватман № 1, которая через край впитывает отмывающую жидкость из маленького стаканчика или чашки Петри. В любом из этих случаев сетку окрашивают сразу же после удаления избытка жидкости фильтровальной бумагой.

Помимо воды, для отмывки могут быть испробованы различные растворы; при их выборе следует учитывать свойства исследуемых частиц, а также то, что соли и другие вещества, мешающие окрашиванию, должны быть обязательно удалены. Во многих случаях для отмывки лучше всего применять 1%-ный водный ацетат аммония, поскольку он не реагирует с бактериями, ми-коплазмами, мембранами, вирусами и большинством внутриклеточных компонентов, а также потому, что его избыток улетучивается в условиях вакуума электронного микроскопа. При первом знакомстве с микроорганизмами из жидких культур в большинстве случаев образующийся после центрифугирования осадок суспендируют в небольшом количестве ацетата аммония и суспензию наносят на сетку. Центрифугирование бактерий в любых целях, в том числе на этапе фиксации и отмывки препаратов, готовящихся методом заливки (разд. 4,1.2), удобнее и быстрее всего проводить в настольных центрифугах, таких, как центрифуги фирм Brinkmann или Eppendorf. Объем конической пластмассовой пробирки в них не должен превышать 1,5 мл.)

Красители

В качестве красителей для негативного окрашивания используются различные соли тяжелых металлов. Наш опыт свидетельствует о том, что самой подходящей солью является молибдат аммония, так как он хорошо распределяется, не реагирует с белками и большинством других компонентов суспензии и его концентрацию легко регулировать для создания требуемой степени контраста [32]. Пожалуй, чаще других используются растворы фосфорновольфрамового натрия и калия, в целом удовлетворительные при нейтральных значениях рН. Широко применяются соли урана, поскольку их молекулы, обладающие небольшими размерами, хорошо проникают в поверхностные неровности и тем самым улучшают разрешение тонких деталей. Уранилацетат, который, как правило, имеется в электронно-микроскопических лабораториях, потому что его используют также при окрашивании срезов, дает хорошие результаты при концентрации ~1% или меньше. Но его растворы имеют очень низкий рН (около 2,5), и, даже будучи частично нейтрализованным непосредственно перед использованием, он начинает выпадать в осадок при рН выше 4,5. Некоторые структуры уранилацетат окрашивает позитивно, и на одной и той же сетке могут быть видны участки как позитивно, так и негативно окрашенные. Ко всему прочему, он действует как фиксатор на белки и нуклеиновые кислоты, вызывает сжатие и округление ограниченных мембранами клеток (например, микоплазм), разрушает некоторые белковые структуры при рН 4,5 и должен применяться только для чистых и хорошо отмытых препаратов. В связи с этим особую ценность приобретает уранилоксалат, так как его можно использовать при нейтральных значениях рН. Иногда также используют уранилформиат, кремневольфрамовокислый натрий и другие соли. Соли урана обладают незначительной радиоактивностью и токсичностью, поэтому во время работы с ними необходимо быть осмотрительными.

Некоторые исследователи советуют добавлять к ряду красителей (например, к фосфорновольфрамату, но не к солям урана) с целью улучшения их распределения незначительные количества удерживающих воду агентов, таких, как сывороточный альбумин, крахмал или сахароза [22]. Не все находят это полезным или необходимым, особенно в тех случаях, когда требуются большие увеличения или хороший фон.

Фиксация

Иногда перед негативным контрастированием оказывается полезной химическая фиксация микроорганизмов. Ее применяют для того, чтобы избежать структурных изменений и искажений из-за действия растворов с разными рН и осмотическими свойствами, из-за действия самих красителей или из-за высушивания в красителе. Фиксацию проводят в растворах глута-ральдегида низкой концентрации, а иногда суспензию на сетке подвергают действию паров глутаральдегида в закрытом сосуде. Перед окраской фиксированные бактерии нуждаются в отмывке либо прямым способом, либо путем отмывки сеток методами, упомянутыми выше. В итоге часто наблюдается в какой-то степени позитивное окрашивание, а задержка красителя вокруг фиксированного микроорганизма такова, что для окрашивания можно применять значительно менее концентрированные растворы красителя.

«Подводные камни», трудности, предосторожности

Много указаний на трудности, встречающиеся в электронной микроскопии, уже было сделано в предшествующих разделах. Когда говорят о доступности электронного микроскопа, подразумевают наличие по крайней мере одного опытного оператора, хорошо знакомого с обслуживанием и эксплуатацией напылительных установок, ультрамикротомов и самого микроскопа. При наблюдении негативно контрастированных образцов особенно важно добиться нужной степени контраста и разрешения, применяя соответствующее ускоряющее напряжение (обычно 60—80 кВ). Заостренные катодные нити электронной пушки желательны, но не обязательны. Загрязнение колонны микроскопа, апертур и образца сводится к минимуму, если заботиться о надлежащем использовании охлаждаемого жидким азотом противозагрязнительного устройства и самоочищающихся золотых апертур объектива. Чтобы устранить дрейф образца, нужно терпеливо провести предварительные эксперименты с электронными пучками разной интенсивности и использовать углеродно-пластмассовые или чисто углеродные пленки-подложки. Повреждение или изменение тонкой структуры под действием пучка электронов, а также образование пятен красителя вокруг образца и на самом образце можно свести к минимуму, если научиться быстро наводить фокус при наименьшей допустимой интенсивности пучка. Для фотографирования при этом следует использовать как можно более короткие выдержки, которые, если учесть применяемую систему проявления фотопленки, соответствуют достижению желаемого контраста. Наилучшие результаты обычно получают с короткими выдержками при относительно низком увеличении; каждый микроскопист методом проб и ошибок определяет для используемого им микроскопа и изучаемого объекта те увеличения, при которых легче всего производится фокусирование и получаются наиболее четкие результаты.

В красителях и в отмывающих растворах (ацетат аммония) или даже в деионизованной и дистиллированной воде при долгом хранении иногда появляются бактерии. Если есть подозрение на присутствие в растворах

log

бактерий, их проверяют в электронном микроскопе. Рабочие растворы красителей (обычно 2°/о-ные растворы молибдата аммония, фосфорно-вольфрамового калия и уранилацетата) хранят в небольших пузырьках, наполняемых по мере надобности из бутылей (с соблюдением стерильности). Загрязненные растворы можно отфильтровать, но лучше всего сделать их заново, чтобы избежать неприятностей, вызываемых маленькими частичками, которые способны проходить через большинство фильтров. Растворы уранилацетата нужно защищать от света, обертывая соответствующую емкость фольгой; их необходимо фильтровать (диаметр пор фильтра 0,2 мкм), если образовался осадок. Удобно разливать растворы пластмассовым шприцем с насаженным на него фильтром типа Swinney.

Распределение по подложке красителя и исследуемых частиц, даже если применяются уже упомянутые методы, может быть неудовлетворительным; поэтому для экономии времени и пользы дела следует готовить две или большее число сеток с одним и тем же материалом.

Сетки просматривают в микроскоп при малых увеличениях. Подходящая для эксперимента сетка, приготовленная путем промокания капли, характеризуется градиентным распределением частиц и красителя от одного края до другого, в пределах которого можно найти область с удовлетворительной плотностью частиц. Если в исходной суспензии концентрация частиц низка или промокание капли дает плохие результаты, то частицы и краситель могут быть найдены лишь на очень маленькой области сетки.

При обработке молибдатом аммония на фокусирующем экране получают менее контрастное изображение по сравнению с обработкой фосфорновольфрамовыми солями и уранилацетатом, и поэтому для работы с ним требуется некоторый опыт. Однако на негативах, проявленных надлежащим образом, получают очень контрастное изображение с большим набором оттенков, воспроизводимых при печати. Молибдат аммония имеет тенденцию плотно окружать большинство бактерий почти непроницаемым слоем. Поэтому для получения хороших результатов на таких крупных объектах, как клетки бактерий, часто требуется окрашивание в течение коротких интервалов времени растворами небольшой концентрации (ОД—0,5%).

Ожидаемые результаты

Какого рода информацию об основных чертах структуры бактерий можно получить методом негативного контрастирования? Это самый простой и самый быстрый метод, который только можно применить (исключая прямой просмотр, который почти бесполезен из-за отсутствия контраста), и поэтому его следует использовать первым. Можно быстро определить размер и форму микроорганиз