Наполнить закрывающуюся стеклянную чашку (дно которой с наружной стороны покрыто черной липкой лентой) деионизованной водой до образования выпуклого мениска у самого верха. Провести чистой стеклянной палочкой, находящейся в контакте с верхними краями чашки, по поверхности воды от края до края чашки, чтобы выровнять мениск и собрать с поверхности всю пыль. (Для перетекающей при этом через край воды под чашку можно подставить поднос.)

7. Осторожно, держа вертикально над подносом покрытое пленкой стекло, капнуть из пастеровской пипетки по бритвенным надрезам формваровой пленки 10%-ную плавиковую кислоту. (Пипетку каждый раз после использования выбрасывать.) Сразу же, но не спеша погрузить находящееся в вертикальном положении стекло в воду. Пленки формвара будут медленно сходить с обеих сторон стекла на водную поверхность, плавая на ней. Визуально проверить пленки (желательно под светом люминесцентной лампы), чтобы оценить их однородность и толщину. Они должны иметь цвет от серого до серебристо-серого и в соответствии с картиной интерференционных полос могут иметь разброс в толщине ±60 нм. Теоретически идеальные значения толщины 10—20 нм достигаются очень редко.

Если однородность или толщина пленки неудовлетворительны, следует повторить описанные выше этапы с некоторыми модификациями. Если пленки неоднородны, стекла, покрытые формваром, нужно сушить дольше и погружать в воду более медленно. Если пленка слишком толста, следует развести раствор формвара дихлорэтаном; если слишком тонка — добавить в раствор немного исходного концентрированного 0,5%-ного формвара и повторить все сначала. При использовании плавиковой кислоты, отделяющей при протравливании формвар от стекла, получают более воспроизводимые результаты, чем при обычном способе, когда на стекло просто дышат.

8. Если плавающие по поверхности воды пленки удовлетворяют всем требованиям, следует аккуратно поместить на них сетки (матовой стороной вниз). Участков пленки с заведомыми нарушениями лучше избегать, чтобы все сетки находились почти в одинаковых условиях.

9. Разрезать пополам кружок фильтровальной бума-ти (Whatman № 1) и, держа половинку над полосой формваровой пленки с сетками, медленно опускать ее на поверхность до тех пор, пока она не пропитается равномерно водой. Затем погрузить бумагу в воду, перевернуть ее и вынуть из воды вместе с пленкой и сетками, которые оказываются при этом между фильтровальной бумагой и пленкой формвара.

10. Поместить бумажный полукруг с сетками в чашку Петри на другой кусок фильтровальной бумаги и неплотно закрыть чашку крышкой на время сушки.

Замечание: не применяйте слишком волокнистую фильтровальную бумагу, так как волокна могут повредить пленку.

После высушивания сетки поднимают за край специальным тонкозаостренным пинцетом. При этом пленка должна разорваться точно по периметру сетки, оставшись на ее поверхности. Если это не происходит или если пленки разрываются не точно по периметру сетки, значит, они слишком толсты; однако чрезмерная толщина может быть лишь на некоторых участках пленки, в то время как другие могут быть вполне удовлетворительными. Пленки, имеющие большие дырки (чего удается обычно избежать, применяя плавиковую кислоту, вместо того чтобы дышать на пленку при ее отделении от стекла), не способны хорошо удерживать жидкость, причем дырки бросаются в глаза при микроскопирова-нии. Большие дырки в подложке получаются также в результате того, что при высушивании окружающая пленку среда обладает слишком высокой влажностью. Чересчур тонкие пленки легко разрываются под действием пучка электронов.

Из-за ионизации и последующих изменений электростатического заряда пленки расширяются и сжимаются, вызывая смещение образца при увеличении и уменьшении интенсивности электронного пучка. Любое возникающее движение приводит к смазыванию фотографического изображения тем больше, чем больше используемое увеличение. Часто регулировка интенсивности пучка и короткое выжидание приводят к стабилизации. Мы считаем, что формваровые пленки, приготовленные описанным способом, вполне удовлетворительны для обычных целей при увеличении, не превышающем 50 000, если тот, кто управляет микроскопом, внимательно следит за условиями микроскопирования и длительностью фотоэкспозиции. Однако для выявления тонких деталей и для работы при большом увеличении используют более стабильные пленки, которые получают путем напыления тонкого (2,0—3,0 нм) слоя углерода. Тонкие пленки чистого углерода предотвращают смещение образцов и улучшают разрешение, поскольку они более равномерны и имеют более тонкую структуру. Их готовят почти полным растворением и удалением большей части пластмассового компонента из покрытых углеродом пленок или отделением на воду углеродных пленок со стеклянных или свежерасщепленных слюдяных поверхностей точно так же, как это делается в случае обычных подложек. Сетки, покрытые углеродными пленками, имеются в продаже. Хотя у этих пленок есть большие преимущества, позволяющие проводить тонкие эксперименты с субклеточными частицами и вирусами, работать с ними нелегко, так как эти нежные и хрупкие пленки требуют осторожного обращения с ними. Пленки можно приготовить также напылением частиц углерода очень малых размеров при испарении углерода с угольных электродов в вакууме [10~5—10~6 мм рт. ст. (1,33—0,13 нПа)]. Эту процедуру осуществляют в напылительной установке — устройстве, для которого существует несколько выпускаемых промышленностью моделей. В современных на-пылительных установках, включающих либо просто устроенные, либо автоматические управляющие системы, процесс напыления сеток почти автоматизирован; они представляют собой неотъемлемую часть каждой электронно-микроскопической лаборатории. Подробно с

использованием напылительных установок (сюда входят также контрастирование образцов и получение их реплик при обработке тяжелыми металлами) читатель может ознакомиться в специальных источниках информации [44, 45].

Окрашивание

Негативное «окрашивание» (контрастирование) — это процесс заключения бактерий или других частиц в тонкую пленку разбавленного раствора соли тяжелого металла, которая затем высыхает на стекле. В отношении используемых красителей и методов их применения (см. ниже) существует множество вариантов. Стандартная методика, применяемая в нашей лаборатории, включает два этапа — сначала нанесение образца, а затем окрашивание 2%-ным молибдатом аммония, как описано ниже.

1. Край сетки с пленкой наверху помещают на край трижды сложенной полоски липкой ленты (и внизу и вверху липкой стороной наружу), прижатой к покровному стеклу.

2. Пастеровской пипеткой на сетку наносят каплю бактериальной или другой суспензии, подлежащей исследованию. Площадь, которую занимает капля, должна совпадать с поверхностью сетки. (Капля удерживается поверхностным натяжением мениска; неводные суспензии или суспензии, содержащие поверхностно-активные вещества, не удерживаются на сетке.)

3. Каплю оставляют на сетке на 1 мин или больше, чтобы бактерии или другие частицы пристали к поверхности пленки. Оптимальное время выдерживания, которое зависит от природы пленки и ее заряда (гидро-фильности), а также размера и природы частиц, определяют методом проб и ошибок. Для улучшения адгезии и распределения частиц можно усилить гидрофильные свойства подложки, применяя покрытые пленкой сетки, выдержанные в холодильнике или недавно облученные ультрафиолетовым светом; для сведения к минимуму электростатического заряда сетки помещают в камеру с высоким вакуумом, где происходит тлеющий разряд или разряд при помощи катушки Теслы. Эффективно также

непосредственно перед нанесением капли образца на сетку использовать пушку зеростата.

4. Вершиной маленького треугольника из фильтровальной бумаги ватман № 1, прикасаются к капле и забирают большую ее часть. Затем тут же краем бумаги прикасаются к краю сетки и быстро забирают остатки жидкости.

5. Пока поверхность сетки не просохла, на нее наносят каплю 2%-ного молибдата аммония.

6. Через 30—60 с удаляют каплю красителя, как описано выше. Время обработки определяют экспериментально.

7. Сеткам дают возможность высохнуть и затем исследуют их с помощью электронного микроскопа.

Для негативного окрашивания суспензий существует несколько взаимозаменяемых методов. В одном из них смешивают равные объемы (можно использовать и другие отношения) красителя и суспензии, наносят одну каплю на сетку, а затем либо сразу, либо по прошествии определенного времени (например, 30 с) удаляют избыток жидкости. Обычно каплю лучше всего наносить сразу после смешивания, поскольку происходящее со временем взаимодействие частиц и красителя может приводить к нестабильным результатам. Иногда выгодно захватить тонкую пленку смеси платино-иридиевой петлей размером чуть больше площади сетки (например, диаметром 3,2 мм) и нанести ею смесь на сетку, лежащую на промокательной бумаге; этим обеспечивается более равномерное распределение частиц. Сетку высушивают и просматривают. Если нанесенного материала больше, чем должно быть в тонкой пленке, то избыток следует удалить фильтровальной бумагой.

Другой метод негативного окрашивания заключается в том, что сетке дают возможность плавать последовательно по поверхности капли суспензии, капли фиксатора или другого агента, капли промывочной воды (несколько раз; см. ниже «Отмывка») и капли с красителем, вслед за чем, как и обычно, сетку подсушивают фильтровальной бумагой (см. выше этап б-й). Капли удобно наносить на пластинку зубного воска, сполоснутого дистиллированной или деионизованной водой для удаления пыли и растворимых солей.

Иногда смеси красителя и суспензии распыляют на сетки, но для этого нужен специальный аппарат; этот метод наиболее полезен для количественной оценки вирусов и других маленьких частиц {26].

При изучении бактерий особенно полезен способ нанесения сеток, покрытых пленкой, на бактериальный газон или колонии. Сразу же после снятия сеток удаляют лишнюю жидкость и проводят окрашивание. Этим способом можно исследова