Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

ого калия и тиосульфата натрия в дистиллированной воде сначала приливают этанол, а затем соляную кислоту. Смесь перемешивают и оставляют на некоторое время для выпадения в осадок серы, после чего собирают надосадочную жидкость.

5. Отмывают стекло 70%-ным (вес/объем) этанолом.

6. Окрашивают препарат реактивом Шиффа в течение 15—45 мин (точное время следует определить экспериментально). Реактив Шиффа готовят следующим образом: 2 г основного фуксина растворяют в 400 мл кипящей дистиллированной воды, охлаждают до 50°С и фильтруют через фильтровальную бумагу. Добавляют к фильтрату 10 мл 2 н. соляной кислоты и 4 г метабисуль-фита калия. Сосуд плотно закупоривают и оставляют на 12 ч в холодном темном месте. Добавляют такое количество 2 н, соляной кислоты (~10 мл), чтобы при высыхании на предметном стекле реактив не давал розового налета. Реактив Шиффа хранят в темноте.

7. Несколько раз отмывают стекло раствором, состоящим из 2 г метабисульфита калия и 5 мл концентрированной соляной кислоты, в 500 мл дистиллированной воды.

8. Отмывают препарат водопроводной водой и дополнительно окрашивают 0,002%-ным (вес/объем) водным раствором малахитового зеленого в течение 2—5 с.

9. Отмывают препарат водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.

Полисахариды окрашиваются в красный цвет, все остальные компоненты цитоплазмы — в зеленый.

Метод окраски полисахаридов алциановым синим

Для выявления полисахаридов можно также использовать алциановый синий. Обычно применяют 1%-ный (вес/объем) раствор алцианового синего в 95%-ном (объем/объем) этаноле, а в качестве дополнительного красителя используют карболфуксин. Последовательность операций такова:

1. Пленку препарата на предметном стекле фиксируют нагреванием.

2. Окрашивают пленку в течение 1 мин разведенным в 9 раз (в воде) алциановым синим, приготовленным, как описано выше.

3. Отмывают препарат водопроводной водой и высушивают.

4. Дополнительно очень быстро окрашивают (не следует допускать перекрашивания!) препарат карболфук-сином (разд. 3.3.6) и сразу же отмывают водопроводной водой. Высушивают пленку на воздухе и смотрят в микроскоп.

Полисахариды окрашиваются в голубой цвет, а другие составляющие цитоплазму компоненты — в красный.

3.4. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

В этот раздел включен ряд методов, которые не являются столь обычными, чтобы их применять при первом ознакомлении с пробами.

3.4.1. Спирохеты

Спирохеты не прокрашиваются удовлетворительно «обычными» красителями, хотя свободноживущие спирохеты хорошо видны в нигрозиновых пленках. Размеры (толщина) многих из них находятся на пределе разрешения светового микроскопа. Обычно эти бактерии наблюдают живыми с помощью прямой темнопольной или фазово-контрастной микроскопии. Полезно знать, что в пленках, окрашенных по Гимзе, спирохеты флуоресцируют ярким золотисто-желтым светом при просмотре с темнопольным освещением.

Хорошие результаты обычно получают при использовании метода Фонтаны.

Метод окрашивания спирохет по Фонтане

1 мл

2 мл 100 мл

Раствор Л (фиксатор):

Уксусная кислота Формалин

Дистиллированная вода

1 г 5 г 100 мл

Раствор В (протрава): Фенол

Дубильная кислота Дистиллированная вода

Раствор С:

К. 0,5%-ному (вес/объем) водному раствору нитрата серебра приливают 10%-ный (вес/объем) раствор водной гидроокиси аммония (по каплям) до тех пор, пока образовавшийся вначале осадок только-только начинает растворяться.

Раствор D: Этанол абсолютный

Методика:

1. Высушивают на воздухе пленку на предметных стеклах, очищенных тем способом, который применяют при окрашивании жгутиков.

2. Фиксируют пленку в растворе А в течение 1 — 2 мин.

3. Отмывают пленку в растворе D в течение 3 мин.

4. Наносят на пленку раствор В и нагревают в течение 30 с, пока не начинает подниматься пар.

5. Отмывают пленку дистиллированной водой и высушивают препарат.

6. Наносят на пленку раствор С и нагревают, пока не начинает подниматься пар, а сама пленка не становится коричневой. Пленку отмывают, высушивают и смотрят в микроскоп.

Спирохеты выглядят коричневато-черными.

3.4.2. Микоплазмы

Микоплазмы, вероятно, представляют собой самые маленькие бактерии, которые можно наблюдать в световой микроскоп и которые с трудом поддаются индивидуальному распознаванию из-за сильно выраженного плеоморфизма. Характерные колонии микоплазм, имеющие вид яичницы-глазуньи, наблюдают при прямой микроскопии чашек с агаром. Для анализа колоний полезен подход, разработанный Динесом и заключающийся в том, что препараты смотрят после того, как на место роста бактерий наносят каплю метиленового синего и накрывают ее покровным стеклом. В случае объектов, близких по размерам к пределам разрешения, оптические измерения при фазово-контрастной микроскопии затруднены по двум причинам. Первая — это ореольные артефакты и вторая — присущие фазовому контрасту особенности формирования изображения, благодаря которым круглые объекты выглядят меньше, чем они есть на самом деле. В морфологических исследованиях и при изучении подвижности микоплазм применяются влажные препараты. Что же касается типа микроскопирова-ния, то рекомендуются методы фазового контраста и темнопольного освещения. Если нужны окрашенные препараты микоплазм, то предпочтительнее использовать несколько модифицированную методику окраски по Гйм-зе (см. ниже), которую следует применять к предварительно фиксированным организмам. Фиксировать микоплазмы лучше раствором Боуэна (разд. 2.2.1) непосредственно в слое агара, лежащем на покровном стекле.

3.4.3. Риккетсии

Риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразитами (за исключением Rickettsia quintana), которые, как правило, имеют палочковидную форму, встречаются парами и обладают выраженным плеоморфизмом. Их можно видеть в пленках инфицированной ткани при прямом микроскопическом анализе, если окрасить препараты по Гимзе или по Гименецу. Большинство рик-кетсий при этом имеют вид фиолетовых коккобацилляр-ных микроорганизмов с различной длиной — от 0,25 до 2 мкм. Чаще всего наблюдаются пары и короткие цепи. Самая маленькая риккетсия — Coxiella burnetii (размер— 0,25x1 мкм) —выглядит, как окрашенная с двух полюсов палочка, находящаяся в цитоплазме инфицированных клеток. Риккетсии тифа и пятнистой лихорадки в целом крупнее (ширина — 3—0,6 мкм, длина — 1,2 мкм). Риккетсии пятнистой лихорадки обнаружены как в ядрах, так и в цитоплазме инфицированных клеток и часто окружены ореолом, иногда ошибочно принимаемым за капсулу.

Инфицированные ткани можно прямо анализировать в флуоресцентном микроскопе, используя специфические антисыворотки, меченные изотиоцианатом флуоресцеина. При окраске по Граму риккетсии красятся как грамотрицательные.

Метод окраски риккетсии по Гимзе

Исходный концентрированный раствор:

Порошок красителя Гимзы 0,5 г

Глицерин 33 мл

Абсолютный метанол (свободный от ацетона) 33 мл

Порошок красителя Гимзы растворяют в глицерине при 55— 60 °С в течение 1,5—2 ч. Добавляют метанол, тщательно перемешивают и оставляют стоять на некоторое время. Хранят реактив, в котором нет осадка, при комнатной температуре.

Для использования одну часть исходного концентрированного раствора разводят в 40—50 раз нейтральной дистиллированной водой или забуференной водой, рН 6,8.

Методика:

1. Образец на предметном стекле высушивают на воздухе, фиксируют 5 мин в абсолютном метаноле и вновь высушивают на воздухе.

2. Наносят на образец свежеприготовленный раствор Гимзы на 1 ч.

3. Отмывают 95%-ным (объем/объем) этанолом для удаления избытка красителя, высушивают на воздухе и смотрят в микроскоп с целью выявления базофильно окрашенных организмов, находящихся внутри цитоплазмы.

Метод окраски риккетсии по Гименецу

Исходный концентрированный раствор:

Основной фуксин 10 г

Этанол 95%-ный (объем/объем) 100 мл

Фенол 4%-ный (вес/объем), водный 250 мл

Дистиллированная вода 650 мл

Сначала краситель растворяют в этаноле, а затем добавляют другие ингредиенты. Перед использованием красящий раствор выдерживают в течение 48 ч при 37 °С.

При использовании красителя исходный концентрированный раствор разводят в отношении 1:2,5 фосфатным буфером, рН 7,45, приготовленным смешиванием 3,5 мл 0,2 М Na2HP04, 15,5 мл 0,2 М Na2HP04 и 19 мл дистиллированной воды. Затем краситель фильтруют. Он может храниться 3—4 дня, но каждый раз перед использованием должен фильтроваться. При окраске этим методом требуется также 0,8%-ный (вес/объем) водный раствор щавелевокислого малахитового зеленого.

Методика:

1. Образец фиксируют нагреванием и наносят на него на 1—2 мин красящий раствор.

2. Отмывают водопроводной водой и окрашивают в течение 5—10 с малахитовым зеленым.

3. Вновь отмывают образец водопроводной водой и второй раз окрашивают малахитовым зеленым.

4. Тщательно отмывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают промокательной бумагой и смотрят в микроскоп.

Риккетсии выглядят как окрашенные в красноватый цвет бактерии на зеленом фоне.

3.4.4. Водные бактерии

При прямом микроскопировании проб морской воды, как правило, выявляется лишь немного бактерий. Для концентрирования микроорганизмов с целью определения их общего числа в единице объема, а также с целью выявления различных морфологических типов приме3. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ В СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ

няется фильтрация. Один из способов фильтрации [7] заключается в следующем.

Фильтры из поликарбоната диаметром 25 мм (с диаметром пор 0,2 мкм) предварительно окрашивают в течение 5 мин в 0,2%-ном (вес/объем) растворе иргале-нового черного (цветовой индекс среди кислых черных красителей № 107, Union Carbide Corp., New York, N. Y) в 2%-ной (объем/объем) уксусной кислоте, отмывают дистиллированной водой и помещают в увлажненном виде в стеклянный аппарат для фильтрования (Millipore Corp., Bedford, Mass.). Заготовленные фильтры, высушенные после предварительной окраски и промывки, перед использованием увлажняют дистиллированной водой, лишенной бактериальных клеток, на специальном держателе для фильтра. Пробу морской воды, фиксированную нейтрализованным (с

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)