ия цист.

Окрашивание цист

Реактив:

Ледяная уксусная кислота Сульфат натрия (безводный) Нейтральный красный Светло-зеленый S.F. желтоватый Этанол 95%-ный (объем/объем) Дистиллированная вода

8,5 мл 3,25 г 200 мг 200 мг 50 мл 100 мл

Все химические реагенты и красители добавляют в воду при постоянном перемешивании в течение 15 мин и затем смесь фильтруют через мембранный фильтр (с диаметром пор 0,5 мкм).

Методика:

Реактив наносят на образец и просматривают влажный препарат под микроскопом. Вегетативные клетки азотобактера окрашиваются в желтовато-зеленый цвет;

на ранних стадиях формирования цист темно-зеленая цитоплазма несколько отстоит от наружной клеточной стенки, их разделяет красно-коричневый слой. В зрелых цистах центральная часть выглядит темно-зеленой и отделяется неокрашенной интиной от расположенной снаружи красно-коричневой экзины.

3.3.9. Капсулы и слои слизи

Капсулы и слои слизи образуются некоторыми бактериями в специфических культуральных условиях. Лучше всего они видны во влажных препаратах, поскольку составляющие их сильно гидратированные коллоидные полимеры легко разрушаются и сокращаются в размерах при высушивании и фиксации.

Самым простым и наиболее эффективным из трех методов окраски капсул, описанных ниже, является метод Дюгида.

Метод окраски капсул по Дюгиду

1. На чистое предметное стекло петлей наносят тушь и смешивают ее с культурой. Покровное стекло помещают таким образом, чтобы была накрыта лишь часть смеси.

2. Сложенной много раз промокательной бумагой сильно прижимают покровное стекло к предметному стеклу до появления тонкого коричневатого слоя жидкости между ними. Препарат смотрят под большим увеличением, применяя безыммерсионные и иммерсионные объективы.

Капсулы выглядят прозрачными зонами вокруг преломляющих свет микроорганизмов на коричневато-черном фоне.

Метод окраски капсул по Гиссу

1. Взятую петлей бактериальную суспензию смешивают с каплей нормальной лошадиной сыворотки или снятого молока на предметном стекле.

2. Высушивают пленку на воздухе и мягко фиксируют ее нагреванием.

3. Покрывают пленку красящим реактивом кристаллического фиолетового (кристаллический фиолетовый

0,1 г, дистиллированная вода 100 мл) и нагревают до появления пара.

4. Отмывают кристаллический фиолетовый 20%-ным (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuS04-5H20). Подсушивают впитывающим воду материалом и смотрят в микроскоп.

Капсулы выглядят бледно-голубыми, а сами микроорганизмы — темно-фиолетовыми.

Метод окраски капсул по Антони

1. Высушенную на воздухе пленку окрашивают в течение 2 мин 1%-ным (вес/объем) водным раствором кристаллического фиолетового.

2. Краситель отмывают 20%-ным (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuS04*5H20), удаляют избыток последнего и подсушивают впитывающим влагу материалом.

Капсулы выглядят светло-голубыми, а микроорганизмы — темно-фиолетовыми.

3.3.10. Жгутики

Хотя Кох разработал способ окраски жгутиков более чем столетие назад, существующие в настоящее время соответствующие методики не отличаются легкостью и надежностью. Поскольку толщина бактериальных жгутиков лежит за пределами разрешения светового микроскопа (жгутики имеют диаметр около 10—30 нм), для того чтобы их увидеть, необходимо, так сказать, «вымазать их дегтем и обвалять в перьях». Неподвижные бактерии лишены жгутиков, однако известны организмы, жгутики которых «парализованы» (fta+mol~).

Метод окраски жгутиков по Грэю

Раствор А:

Дубильная кислота [20%-ная (вес/объем) водная] 2 мл

Калийные квасцы [КА1 (SC^b* 12Н^О), насыщенные 5 мл

водные]

Хлористая ртуть, насыщенный водный раствор 2 мл

Основной фуксин 3%-ный (вес/объем) в 95%-ном 0,4 мл (объем/объем) этаноле

Краситель желательно добавлять к остальным ингредиентам непосредственно перед использованием и конечный раствор отфильтровывать.

Раствор В:

Карболфуксин, приготовленный по Цилю (разд. 3.3.6) Методика:

1. Обычные бактерии удобно выращивать на косячках агара с соответствующим содержанием питательных веществ. За 0,5 ч до взятия пробы в пробирку с косячком добавляют водный раствор пептона, в который переходят микроорганизмы, так как жидкая среда является наиболее подходящей в подобных экспериментах. Затем пробу центрифугируют, чтобы освободиться от составных элементов среды, промывают и вновь центрифугируют. Осадок осторожно (чтобы предотвратить потерю жгутиков) ресуспендируют в 10%-ном (объем/объем) водном формалине до получения слегка мутной суспензии.

2. Суспензию петлей наносят на предметное стекло, наклоняют его под углом 45° и подсушивают препарат на воздухе.

3. Фильтруют прямо на пленку раствор А и оставляют его на ней приблизительно на 6 мин. Точное время следует определить экспериментально.

4. Раствор А смывают с предметного стекла дистиллированной водой.

5. На пленку кладут кусочек промокательной бумаги и заливают на 3 мин раствором В.

6. Удаляют промокательную бумагу, промывают предметное стекло дистиллированной водой, осторожно подсушивают впитывающим влагу материалом и смотрят в микроскоп.

Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в красный цвет. Значительная доля успеха в осуществлении метода зависит от использования абсолютно чистых обезжиренных предметных стекол. Чтобы обеспечить чистоту стекол, их нагревают либо в пламени горелки Бунзе-на, до тех пор пока пламя по краям стекла не становится желтым (после чего стеклам дают остыть), либо в муфельной печи в течение 20 мин при 400 °С (предметные стекла в печи располагают так, чтобы они не соприкасались). После охлаждения стекла используют немедленно или хранят в емкости, не содержащей пыли. Стекла также становятся очень чистыми, если их сначала протереть жидким очистителем Bon Ami, а затем бумажной тканью Kleenex. Не рекомендуется применять для очистки стекол, на которых красят жгутики, такие очищающие агенты, как хромовая кислота или 50%-ный (объем/объем) спирт.

Метод окраски жгутиков по Ляйфсону

Раствор 1:

Хлористый натрий 1,5 г

Дистиллированная вода Ю мл

Раствор 2'

Дубильная кислота 3,0 i

Дистиллированная вода 100 мл

Раствор 3:

Уксуснокислый л-розанилин 0,9

Солянокислый /г-розанилин 0,3

Этанол 95%-ный (объем/объем) 100 мл

Смешивают равные объемы растворов 1 и 2; затем два объема получившейся смеси приливают к одному объему раствора 3. В охлажденном виде полученная смесь хранится 1—2 мес.

Методика:

1. Высушенный на воздухе образец готовят в соответствии с 1-м и 2-м этапами метода Грэя.

2. Восковым стеклографом очерчивают вокруг бактериальной пленки прямоугольник.

3. Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя, так чтобы нисколько не вытекло за пределы восковой линии. Оставляют краситель приблизительно на 7—15 мин; оптимальное время реакции следует определить экспериментально.

4. Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка и при освещении снизу будет видно, что вся пленка сплошь покрыта осадком, краситель удаляют, заставляя «плыть» эту пленку по поверхности пущенной из-под крана струи воды. Пленку высушивают на воздухе и смотрят в микроскоп.

Тела и жгутики бактерий окрашиваются в красный цвет.

3.3.11. Цитоплазматические включения

У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них — отложения жира, поли-р-оксимасля-ной кислоты, полифосфата, крахмалоподобных полисахаридов, серы и различных кристаллов. Некоторые из них представляют собой полимеризованные ненужные продукты, а другие можно отнести к запасам питательных веществ. Для выявления этих включений, которые к тому же преломляют свет, применяется несколько методик окраски.

Окрашивание поли-р-оксимасляной кислоты

Для выявления цитоплазматических включений в бактериях используют следующий метод:

1. Фиксированную нагреванием бактериальную пленку образца на предметном стекле погружают в раствор 0,3%-ного (вес/объем) Судана черного В, приготовленного на этиленгликоле. Фильтруют и окрашивают в течение 5—15 мин (время определяют экспериментально).

2. Краситель сливают и препарат высушивают на воздухе, положив предметное стекло на промокательную бумагу.

3. Несколько раз погружают и промывают предметное стекло в ксилоле, а затем подсушивают впитывающим ксилол материалом.

4. Дополнительно окрашивают препарат в течение 5—10 с 0,5%-ным (вес/объем) водным сафранином.

5. Промывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.

Включения поли-р-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие капельки, в то время как цитоплазма окрашивается в розовый цвет.

Окрашивание полифосфата

Включения, состоящие из неразветвленных структур с элементным составом Мл+гРяОзл-гь выявляют следующим образом.

1. Бактериальную пленку образца на предметном стекле фиксируют нагреванием.

2. Окрашивают пленку в течение 10—30 с в растворе метиленового синего по Лёфлеру или в 1%-ном (вес/объем) толуидиновом синем.

3. Отмывают краситель водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.

При окраске метиленовым синим гранулы полифосфата выглядят шариками, имеющими цвет от синего до фиолетового, а вся остальная цитоплазма окрашивается в светло-голубой цвет. Толуидиновый синий окрашивает метахроматически, и гранулы имеют красный цвет на фоне голубой цитоплазмы.

Окрашивание полисахаридов с использованием реактива Шиффа

Этим методом выявляют гликогеноподобные вещества.

1. Пленку суспензии на предметном стекле фиксируют нагреванием.

2. На 5 мин на стекло наносят раствор периодата [20 мл 4%-ной (вес/объем) йодной кислоты в воде, 10 мл 0,2 М водного ацетата натрия и 70 мл 95%-ного этанола; защищать раствор от света!].

3. Отмывают стекло 70%-ным (объем/объем) этанолом.

4. На 5 мин наносят на предметное стекло восстанавливающий раствор, содержащий 300 мл этанола, 5 мл 2 н. соляной кислоты, 10 г йодистого калия, 5 г тиосульфата натрия (пятиводного), 200 мл дистиллированной воды. Восстанавливающий раствор готовят следующим образом: к раствору йодист