Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

по каплям наносят обесцвечивающий растворитель до тех пор, пока в скапывающем со стекла растворителе не исчезнет окраска. После этого пленку подсушивают на воздухе.

5. На 5—10 с пленку погружают в дополнительный краситель.

6. Пленку промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке и подсушивают ее промокательной бумагой.

При использовании любой из методик грамположи-тельные бактерии окрашиваются в голубой или фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный.

Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка слишком толста, а обесцвечивание не проведено до конца. В то же время грамположительные микроорганизмы могут выглядеть, как грамотрицательные, если пленка чересчур обесцвечена; особенно это характерно для культур, очень долго находившихся в стационарной фазе роста. Некоторые виды Bacillus грамположительны лишь в течение нескольких делений после прорастания спор. Грамположительные организмы могут окраситься как грамотрицательные, если нарушена механически целостность их клеточных стенок в результате гибели клеток, автолиза, действия ферментов (например, лизоци-ма), высушивания на стекле и последующего увлажнения. Для получения хороших результатов лучше всего готовить относительно прозрачные пленки (со слабой замутненностью) из молодых активно растущих культур, так как более старые культуры имеют тенденцию давать неустойчивые реакции. Целесообразно в качестве контроля использовать известные грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

3.3.6. Окрашивание на кислотоустойчивость

Второе важное тинкториальное свойство бактерий заключается в том, что некоторые из них плохо обесцвечиваются смесью кислота — спирт после окрашивания горячими растворами карболфуксина. В эту маленькую группу, известную под названием «кислотоустойчивая», входят некоторые актиномицеты, микобактерии, отдельные родственные им бактерии и покоящиеся эндоспоры.

Метод окрашивания на кислотоустойчивость по Цилю — Нильсену

Карболфуксина вый краситель:

Основной фуксин 0,3 г

Этанол 95%-ный (объем/объем) 10 мл

Фенол (кристаллы, расплавленные при нагревании) 5 мл

Дистиллированная вода 95 мл

Основной фуксин растворяют в этаноле и затем добавляют растворенный в воде фенол. Раствор перемешивают и оставляют стоять несколько дней. Перед использованием его фильтруют.

Растворитель для обесцвечивания:

Этанол 95%-ный (объем/объем) 97 мл

Соляная кислота (концентрированная) 3 мл

Дополнительный краситель:

Метиленовый синий, солянокислая соль 0,3 г

Дистиллированная вода 100 мл

Методика:

1. Предметное стекло с высушенной на воздухе и фиксированной прогреванием бактериальной пленкой помещают на держатель для предметных стекол, находящийся над кюветой. Погружают пленку в карболфук-синовый краситель. Предметное стекло осторожно подогревают снизу на горелке Бунзена или на горячей пластине до отхождения паров (не допускать кипения!). В этих условиях препарат держат 5 мин, периодически подогревая его по мере надобности (перегрев вызывает разбрызгивание краски и растрескивание стекла). Пленку промывают слабой, идущей под углом струей водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке.

2. Пленку погружают в обесцвечивающий раствор и сразу же отмывают водой из-под крана, как описано выше. Обесцвечивание и отмывку повторяют до тех пор, пока пленка на вид не станет бледно-розовой.

3. Погружают пленку на 20—30 с в дополнительный краситель, отмывают водопроводной водой, как описано выше, подсушивают промокательной бумагой и смотрят в микроскоп.

Кислотоустойчивые бактерии выглядят красными, а все остальные — синими.

Кислотоустойчивость того или иного организма можно также определить флуоресцентным методом. У этого метода есть одно преимущество, заключающееся в том, что стекла с образцами, в которых подозревается присутствие, например, микобактерий, можно просматривать под объективом с увеличением 60Х> а не ЮОХ; следовательно, все стекло целиком можно просмотреть за короткое время.

Метод Труанта окрашивания на кислотоустойчивость

1,50 г 0,75 г 75 мл 10 мл 50 мл

Оба красителя тщательно перемешивают с 25 мл воды и фенолом. Затем добавляют оставшуюся воду и глицерин и снова перемешивают. Получившийся реактив для флуоресцентной окраски фильтруют через стекловату и хранят при 4°С или при комнатной температуре.

Растворитель для обесцвечивания:

Этанол 70%-ный (объем/объем) 99,5 мл

Соляная кислота (концентрированная) 0,5 мл

Дополнительный краситель:

Марганцовокислый калий 0,5 г

Дистиллированная вода 99,5 мл

Методика:

1. Погружают слегка фиксированную нагреванием бактериальную пленку на 15 мин в реактив для флуоресцентной окраски при 20—37 °С.

2. Промывают пленку под слабой, падающей под углом струей дистиллированной воды, пока сток не станет бесцветным.

3. На 2—3 мин погружают пленку в обесцвечивающий растворитель, затем промывают дистиллированной водой, как описано выше.

4. Погружают пленку в дополнительный краситель на 2—4 мин.

5. Отмывают дистиллированной водой, как описано выше, и подсушивают промокательной бумагой.

Просматривают образцы в люминесцентный микроскоп с использованием возбуждающего светофильтра BG-12 и запирающего светофильтра OG-1. Клетки кислотоустойчивых бактерий флуоресцируют желто-оранжевым светом на темном фоне.

3.3.7. Эндоспоры

Неокрашенные эндоспоры живых бактерий имеют при наблюдении в обычный микроскоп черное обрамление и ярко светятся в плоскости, находящейся немного выше положения истинного фокуса. Не следует считать, однако, что любая сильно преломляющая свет структура внутри бактерии — это эндоспора, особенно если отсутствует информация о теплоустойчивости (разд. 20.1.52). Прямой тест на присутствие эндоспор возможен благодаря явлению, которое наблюдается [12] во многих эндоспорах после погружения в окислитель в кислой среде (например, 0,1%-ный КМп04 в 0,3 н. HN03 или 0,3 н. НС1). При этом оболочка споры теряет целостность, а часть ее протоплазмы, теперь легко окрашиваемая основными красителями, выпячивается наружу через образовавшуюся брешь. Из-за поразительной скоротечности происходящего события (менее 20 мин пребывания в растворе окислителя) этот тест заслуживает названия «проверки на лопанье» (popping test). Его удобно проводить, помещая высушенную на покровном стекле пленку спор на 10—20 мин в раствор окислителя; «лопнувшие» споры видны без окраски, хотя последняя делает их более легко различимыми.

Имеется несколько удовлетворительных методов для окрашивания эндоспор в бактериях. При использовании простейшего из них — негативного окрашивания — получают нефиксированные препараты, материал которых имеет негативный вид. Для осуществления метода взятый петлей 7%-ный (вес/объем) водный нигрозин смешивают на покровном стекле с набранной петлей культурой, смесь распределяют в виде тонкой пленки и высушивают на воздухе. Покровное стекло переворачивают пленкой вниз, помещают на предметное стекло и закрепляют в нескольких местах свечным воском. Эндоспоры выглядят, как сильно преломляющие свет сферические или эллипсоидальные образования, находящиеся как внутри, так и за пределами клеток бактерий [12].

Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашиванию, но, будучи однажды окрашенными, они довольно устойчивы и к обесцвечиванию. Полезным методом позитивного окрашивания бактериальных эндоспор является метод Дорнера.

Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру

1. Образец, фиксированный нагреванием на предметном стекле, высушивают на воздухе и покрывают его

квадратным кусочком промокательной бумаги или салфетки, подогнанным по размеру стекла.

2. Насыщают бумагу раствором карболфуксина

(разд. 3.3.6) и выпаривают его 5—10 мин, как описано

выше, поддерживая влажное состояние добавлением

красителя по мере надобности. Выпаривать можно и

по-другому, помещая стекла на штатив, находящийся

над емкостью с кипящей водой.

3. Удаляют промокательную бумагу и обесцвечивают пленку смесью кислота — спирт в течение 1 мин; промывают водопроводной водой и подсушивают промокательной бумагой.

4. Высушивают тонкий, нанесенный на предметное стекло слой водного насыщенного раствора нигрозина и просматривают стекло в микроскоп (раствор нигрозина готовят следующим образом: смесь 10 г нигрозина и 100 мл дистиллированной воды погружают на 30 мин в кипящую воду, охлаждают и для лучшего хранения добавляют 0,5 мл формалина; перед использованием смесь фильтруют).

Вегетативные клетки бесцветны, эндоспоры окрашены в красный цвет, а фон — в черный.

В модифицированном методе Дорнера в пробирке смешивают водную суспензию бактерий с равным объемом карболфуксина. Пробирки опускают на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем набранный петлей 7%-ный водный нигрозин смешивают на покровном стекле с небольшим количеством (одна петля) подвергшейся нагреванию суспензии бактерий; после подсушц3. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИЙ в СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ

вания на воздухе образуется тонкая пленка. Результаты получают те же, что указаны выше, но методика менее трудоемкая.

Метод окраски эндоспор по Шеферу — Фултону

В этом методе вместо карболфуксина применяется 0,5%-ный (вес/объем) водный малахитовый зеленый. Образец высушивают на воздухе на предметном стекле, фиксируют нагреванием, покрывают промокательной бумагой или бумажной салфеткой, пропитанной до насыщения красителем, и помещают на 5 мин над кипящей водой. Стекло промывают водопроводной водой и бактериальную пленку дополнительно окрашивают 30с сафранином, как в случае окраски по Граму. Затем вновь промывают и подсушивают пленку промокательной бумагой. Эндоспоры окрашиваются в ярко-зеленый цвет, а вегетативные клетки — в красно-коричневый.

3.3.8. Цисты

Бактериальные цисты, имеющиеся у видов Azotobac-ter например, при простом окрашивании прокрашиваются слабо; обычно они выглядят, как сферические тела, окруженные толстыми, но плохо прокрашенными стенками. Описанный ниже метод [14] пригоден для выявления цист азотобактера, в том числе форм, образующихся до созреван

страница 13
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.05.2017)