и объекта-микрометра. Если, к примеру, между двумя соседними линиями последнего помещается 10 линий окуляра-микрометра, то каждый просвет между ними равен 1,0 мкм. После калибровки объект-микрометр больше не нужен, но для каждого применяемого объекта калибровку следует проводить заново.

Филярный микрометрический окуляр имеет измерительную нить, положение которой регулируется вращающейся микрометрической ручкой. Каждому полному обороту ручки соответствует номинальное значение 10 мкм, нить при этом смещается на 1,0 мм. Переместив нить на известное по объекту-микрометру расстояние и подсчитав число делений на барабане ручки, пройденных при этом, можно прикинуть, сколько микрометров приходится на одно деление барабана.

3. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ в СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ

3.3.2. Форма

Для идентификации и в описательных целях (гл. 20) форму бактерий принято обозначать следующим образом: прямая, изогнутая, спиральная, коккобациллярная, ветвящаяся, плеоморфная, с квадратным концом, с округлым концом, лентовидная и веретеновидная. К этим классическим терминам можно, пожалуй, добавить звездчатую, стебельчатую и дольчатую формы. Взаимное расположение отдельных бактерий описывается такими терминами, как одиночные пары, короткие цепи (менее пяти бактерий), длинные цепи (более пяти бактерий), скопления, тетрады, октеты, комки и нити.

Когда в учебнике бактерии описываются с помощью этих терминов, подразумевается, что природные ансамбли не нарушены. Вместе с тем при чрезмерном встряхивании, например, длинные цепи клеток могут разбиваться, а из одиночных клеток могут образовываться комки. Разрушение длинных цепей или других непрочных группировок клеток сводят к минимуму добавлением к культуре формальдегида до 1—2% (объем/объем); культуру инкубируют с формальдегидом 15 мин, затем ее центрифугируют и ресуспендируют в воде для приготовления пленок или негативного окрашивания. Эта процедура особенно рекомендуется для стрептококков. Следует также принимать во внимание последствия, связанные с возрастом культуры и составом среды.

3.3.3. Способ деления клеток

Способ деления данной бактерии обычно не выявляется при первом поверхностном осмотре препарата; для этого требуются продолжительные наблюдения живых клеток в подходящей среде [5, 10]. Методики простого окрашивания не позволяют с достаточной точностью определить, к какому типу относится деление — делению на две или на три клетки, делению почкованием или фрагментацией. Для этой цели может оказаться необходимым окрашивание клеточной стенки или даже электронная микроскопия.

3.3.4. Подвижность

Поступательное перемещение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев слабый или безыммерсионный сильный объектив. Скорость перемещения бактерий варьирует, и медленно движущиеся организмы следует отличать от тех, которым свойственно лишь броуновское движение. Описаны некоторые неподвижные мутанты, обладающие жгутиками (тип fla+mot-). Чтобы убедиться в том, что жгутики действительно присущи данной бактерии, а также чтобы определить их расположение (полярное, перитрихиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания (разд. 3.3.10).

Если используется обычный конденсор и масляноим-мерсионный объектив, для улучшения контраста количество света нужно уменьшить апертурной диафрагмой, а конденсор опустить. Наиболее эффективный (и наиболее демонстративный) способ наблюдения за подвижными микроорганизмами при малом увеличении — это тем-нопольная микроскопия. Необходимые для нее специальные конденсоры доступны далеко не всем, однако вполне удовлетворительное темное поле можно получить, применив для освещения иммерсионный конденсор от фазово-контрастного микроскопа и расположенную на нужном месте фазовую пластинку; наблюдения при этом ведут с помощью обычных (не фазово-контрастных) объективов с увеличением 10Х или 45Х. Иммерсионная жидкость на конденсор не наносится, а его положение, для которого характерно самое хорошее темное поле, находится экспериментальным путем. С помощью этого ухищрения оказывается возможным видеть под малым увеличением даже спирохет!

Некоторым бактериям присущ особый тип поступательного движения при контакте с твердой поверхностью, известный как «скольжение». Это относительно медленное, моментами прекращающееся, а затем возобновляющееся продвижение в направлении, параллельном продольной оси организма. Для скольжения характерна частая смена направлений движения и отсутствие наружных локомоторных органелл [8]. Такого типа подвижность можно предположить, если при микроскопическом обследовании (с безиммерсионными объективами большого увеличения) краев колоний обнаруживают отделенные от самого края одиночные клетки или группы клеток. Часто в первичной среде выделения скольжение не выявляется; обычно его легче обнаружить на твердых средах с небольшим количеством питательных веществ, соответствующих их содержанию в естественной для данной группы среде обитания.

Скольжение следует отличать от роения, которое выражается в движении за счет жгутиков в особых условиях. Роение — это распространение микроорганизмов по относительно сухим поверхностям, например агара, где они движутся в виде больших протяженных островков или микроколоний [6]. У наблюдаемых при этом скоплений постоянно меняются очертания — от коротких языковидных выступов и изолированных групп до переплетающихся полос, чередующихся с пустотами. В местах этих пустот видны следы движения, часто рассматриваемые в качестве признака скольжения и хорошо сохраняющиеся фиксацией по Боуэну in situ (разд. 2.2.1). Молодые активные культуры нитевидных организмов, передвигающихся скольжением, оставляют волнообразные, завитые или спиралевидные рисунки. Поступательное перемещение путем скольжения происходит со скоростью 10—15 мкм/с.

3.3.5. Окраска по Граму

Окраска по Граму представляет собой самый важный метод идентификации бактерий. Теоретически возможно разделение бактерий на две группы: гоамположитель-ные и грамотрицательные; реально же имеются случаи, когда одни и те же бактерии характеризуются как «грамвариабельные». С тех пор как метод был впервые разработан Кристианом Грамом в 1884 г., опубликованы многочисленные модификации окраски по Граму.

Пленка бактерий для окрашивания на предметном стекле может быть получена прямым методом из культуры в жидкой или твердой среде [случай простого окрашивания (разд. 3.2.5)], но лучше всего приготовить ее из фиксированной формалином отмытой пробы. Несколько дополнительных минут, потраченных на суспен-дирование бактерий в 5%-ном (объем/объем) формалине, сбор и промывка их центрифугированием, окупаются тем, что при этом размер и форма клеток хорошо сохраняются, клетки прокрашиваются равномерно, а беспорядочно разбросанные преципитаты из жидких культу-ральных сред отсутствуют. В любом случае рекомендуется высушивать пленку на воздухе и фиксировать ее нагреванием, как для простого окрашивания. Важно стандартизировать методику окраски по Граму [4]. Одинаковые результаты дают два способа окраски — в модификации Хукера и в модификации Бёрка.

Окраска по Граму в модификации Хукера

Раствор А для приготовления красящего реактива:

Кристаллический фиолетовый (с гарантированным 2,0 г

90%-ным содержанием сухого вещества)

Этанол 95%-ный (объем/объем) 20 мл

Раствор В для приготовления красящего реактива:

Щавелевокислый аммоний 0,8 г

Дистиллированная вода 80 мл

Растворы А и В смешивают для получения красящего реактива кристаллического фиолетового. Оставляют на 24 ч и перед использованием фильтруют через фильтровальную бумагу.

Протрава:

Йод 1,0 г

Йодистый калий 2,0 г

Дистиллированная вода 300 мл

Йод и йодистый калнй размельчают в ступке и медленно добавляют воду при постоянно продолжающемся размельчении, пока иод не растворится. Хранят в темной склянке.

Растворитель для обесцвечивания: Этанол 95%-ный (объем/объем)

Дополнительный краситель:

Сафранин О [2,5°/о (вес/объем) в 95%-ном (объ- 10 мл

ем/объем) этаноле]

Дистиллированная вода 100 мл

Методика:

1. Высушенную на воздухе фиксированную нагреванием бактериальную пленку погружают на 1 мин в красящий раствор кристаллического фиолетового.

2. Пленку промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с.

3. Пленку помещают в йодную протраву на 1 мин.

4. Промывают пленку в слабой, идущей под углом

3. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ В СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ

струе водопроводной воды в течение 2 с, после чего ее подсушивают промокательной бумагой.

5. Погружают пленку на 30 с в 95%-ный (объем/объем) этанол, взбалтывая последний, после чего пленку подсушивают промокательной бумагой.

6. Погружают пленку на 10 с в дополнительный краситель.

7. Промывают пленку в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, после чего пленку подсушивают промокательной бумагой.

Окраска по Граму в модификации Бёрка

Раствор А:

Кристаллический фиолетовый (с гарантированным 1,0 г

90%-ным содержанием сухого вещества)

Дистиллированная вода 100 мл

Раствор В:

Двууглекислый натрий 1,0 г

Дистиллированная вода 100 мл

Йодная протрава:

Иод 1,0 г

Йодистый калий 2,0 г

Дистиллированная вода 100 мл

Протраву готовят так же, как при модификации Хукера.

Растворитель для обесцвечивания {Предупреждение: осторожно, легко воспламеняется!):

Этиловый эфир 1 объем

Ацетон 3 объема

Дополнительный краситель:

Сафранин О (с 85%-ным содержанием сухого ве- 2,0 г

щества)

Дистиллированная вода 100 мл

Методика:

1. Высушенную на воздухе фиксированную нагреванием бактериальную пленку погружают в раствор А, добавляют 2—3 капли раствора В и выдерживают в течение 2 мин.

2. Отмывают пленку йодной протравой, после чего покрывают ее на 2 мин свежей протравой.

3: Пленку промывают в слабой, идущей под углом струе воды из-под крана в течение 2 с; поверхность BQкруг пленки подсушивают промокательной бумагой, но саму пленку предохраняют от высыхания.

4. На пленку при наклонном положении предметного стекла