Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

я длины и ширины клеток (см. ниже), так как вокруг клеточной стенки может находиться капсула или слой слизи. Более того, отрицательно заряженные частицы коллоидного нигрозина не реагируют с клеточной поверхностью, поскольку при физиологических значениях рН последняя также заряжена отрицательно. При высыхании коллоидной пленки благодаря одинаковому заряду коллоидных частиц и бактерий черный край высыхающей пленки находится на относительно значительном, хотя и маленьком абсолютно расстоянии от истинной границы клетки. В результате видимый размер бактерии оказывается больше, чем действительный, даже если нет капсулы.

В растворах нигрозина могут завестись посторонние микроорганизмы; предотвратить это помогает небольшая добавка формальдегида, не ухудшающая свойств раствора.

3.2.5. Простое окрашивание

Морфологические исследования бактерий, как правило, проводятся на фиксированных и окрашенных препаратах. При использовании только одной краски процесс называют простым окрашиванием. Исследуемую пробу распределяют по предметному стеклу на площади 1 см2. Для этого достаточно одной петли культуры, выращенной в жидкой среде, или одной капли стерильной дистиллированной воды, в которой суспендировано небольшое количество культуры, взятой с твердой среды с помощью иглы или петли. (Бульонные культуры не всегда подходят из-за образующегося при фиксации белкового преципитата; поэтому во многих случаях можно улучшить качество препарата фиксацией в формалине с последующими центрифугированием и отмывкой.) Когда препарат высыхает, производят тепловую фиксацию (фламбирование), проводя несколько раз предметное стекло материалом вверх над пламенем горелки Бун-зена, чтобы убить выжившие организмы и обеспечить прикрепление бактериальной пленки к стеклу. Высушивание и нагревание вызывают сжатие и деформацию бактерий и могут нарушить структуру связей между клетками; не забывайте об этом при интерпретации морфологических данных.

Более четко, хотя и с большими затратами времени, фиксацию осуществляют с помощью химических агентов. Проста и часто вполне удовлетворительна фиксация 5%-ным формалином (объем/объем) в течение нескольких минут, особенно для окраски по Граму (разд. 3.3.5). Подробное описание фиксации четырехокисью осмия (разд. 2.2.2) и по Боуэну (разд. 2.2.1) см. в гл. 2. В последнем случае берут бактерии, выросшие за несколько часов в микроколонии или распределенные до монослоя на твердой среде в чашке Петри. Кусочек агара с бактериями вырезают, фиксируют и переносят на покровное стекло, а затем окрашивают соответствующим образом одним из основных красителей или специально обрабатывают для получения цитохимической информации. Эту методику применяют к молодым культурам всего через несколько часов после посева на агар, когда формируется сплошной слой из микроколоний. Лучше всего заливать агар соответствующей суспензией и отсасывать избыток пастеровской пипеткой, наклоняя чашку. После этого чашку подсушивают и инкубируют. Влажные пленки бактерий на покровных стеклах фиксируют и до высушивания, выдерживая их в парах 2%-ного (вес/объем) водного Os04 в течение 2—3 мин. Но намного лучше фиксировать клетки, подготавливая их к окраске, после того как клеточная суспензия была распределена по поверхности стерильного агара и жидкость впиталась в агар.

В описанных выше методах бактерии находятся на покровном стекле, а предметное стекло служит основанием. С цитологической точки зрения лучше, если фиксированные химическим путем и слегка окрашенные бактерии при монтировании препарата будут в воде и если их высыхание предотвращено на всех этапах обработки. Препараты, фиксированные Os04, не прокрашиваются достаточно хорошо при простом окрашивании, если они не прошли вторую фиксацию, например фиксатором Шаудина [6,6 мл насыщенной HgCl2> 33,3 мл абсолютного этанола и 2%-ная (объем/объем) ледяная уксусная кислота, добавленная перед использованием; 6,9 г HgCl2 в 100 мл воды при 20°С дает насыщенный раствор].

Клетки, интенсивно окрашенные для общеморфологического изучения, получают погружением на короткий срок препаратов, фиксированных нагреванием или химическими агентами, в растворы основных красителей, таких, как кристаллический фиолетовый (на 10 с) и мети-леновый синий (на 30 с), после чего их промывают водопроводной или дистиллированной водой и подсушивают впитывающим воду материалом. Готовят красители следующим образом:

Кристаллический фиолетовый (по Хукеру)

Кристаллический фиолетовый 2 г

Этанол 95%-ный (объем/объем) 20 мл

Щавелевокислый аммоний 1%-ный (вес/объем) 80 мл

водный

Кристаллический фиолетовый растворяют в этаноле, затем добавляют раствор щавелевокислого аммония и выдерживают перед использованием 48 ч.

Метиленовый синий (по Лёфлеру)

Метиленовый синий солянокислый 1,6 г

Этанол 95%-ный (объем/объем) 100 мл

КОН 0,01%-ный (вес/объем) водный 100 мл

Готовят насыщенный спиртовой раствор метилеиового синего, добавляя краситель к спирту. Затем вливают 30 мл этого раствора в раствор КОН.

Если клетки окрашиваются слабо или совсем не окрашиваются одним из этих красителей, то их можно окрасить карболфуксином; при этом не исключено, что они окажутся кислотоустойчивыми в отношении красителя (разд. 3.3.6). Для большинства бактерий достаточно выдержать в этом красителе несколько секунд; это очень мощный краситель, и часто он дает чрезмерную окраску. Однако в случае микобактерий необходимо нагревание или добавление поверхностно-активных веществ, причем, для того чтобы карболфуксин проник через клеточную стенку, содержащую воскоподобные компоненты, требуется какое-то время.

3.2.6. Постоянные препараты

Окрашенные бактериальные пленки на покровных стеклах можно смонтировать в препарат, заключив их в воду на предметном стекле и запечатав края покровного стекла петролатумом, прозрачным лаком для ногтей или свечным воском. Такие препараты временны, их можно использовать лишь в течение нескольких дней, они представляют собой превосходный материал для микрофотографирования. Чтобы увеличить срок хранения, окрашенные и высушенные на покровном стекле пленки бактерий нужно осветлить в ксилоле и положить на каплю канадского бальзама на предметное стекло; следует избегать применения избыточного количества бальзама, а в крайнем случае вытирать его тканью, смоченной в ксилоле. Имеются в продаже и нейтральные среды для заключения препаратов, такие, как, например, флотекс, DPX и пермаунт. Эти среды состоят из пластмассы (полистирол) с пластификатором (трикрезилфосфат), растворенной в органических растворителях (толуол, ксилол). Флотекс можно наносить прямо на окрашенную бактериальную пленку, находящуюся на предметном стекле, без применения покровного стекла. Пермаунт является нейтральной средой, которая не закисляется и не обесцвечивается при хранении; при заключении в пермаунт удается избежать накопления пузырьков воздуха под покровным стеклом.

3.3. ОБНАРУЖЕНИЕ ПРИЗНАКОВ

Как было показано, описываемые ниже методы удовлетворительны для выявления характерных признаков бактерий, необходимых для их идентификации. Вместе с тем их можно улучшить или модифицировать; литература изобилует описаниями незначительных изменений, которые, как выяснилось, были необходимы для получения оптимальных результатов в специфических условиях. В особой заботе при фиксации, окраске и микро-скопировании нуждаются цитологические препараты. Меры предосторожности, которые необходимы при работе с ними, приводятся здесь, а также в гл. 1 и 2. Методы, которые описаны ниже, считаются рутинными, но это самые эффективные методы (особенно если дело касается цитоплазматических включений) применительно к химически фиксированным препаратам, при обработке которых на всех этапах избегают высушивания.

3.3.1. Размер

К сожалению, измерения длины и ширины бактерий далеко не всегда проводятся с необходимой точностью из-за неизбежных технических трудностей. Границы клеток живых бактерий, исследуемых в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе, видны не четко. При фа-зово-контрастной микроскопии границы клеток плохо видны из-за ореолов, которые ухудшают также видимость деталей внутреннего строения. Улучшения можно достичь, поместив микроорганизмы в среду с большим показателем преломления, что нетрудно сделать, если добавить желатину до концентрации 15—30% (вес/объем) [9]. Точную концентрацию, при которой получают наилучшие результаты, нужно определять экспериментально для каждого типа микроорганизмов и их компонентов.

Менее точный метод заключается в быстром высушивании на предметных стеклах тонкой пленки 15—20%-ного (вес/объем) раствора желатины. Пленки применяют для монтирования препаратов в жидкой среде; желатина при этом набухает, иммобилизуя погруженные в нее часть i. морфология

клетки, и благодаря ее присутствию улучшаются фазовые соотношения между микроорганизмом и средой.

В фиксированных и окрашенных препаратах микроорганизмы в некоторой степени деформируются, причем степень деформации зависит от примененной методики; понятно, что при этом получают лишь приблизительные размеры. В высушенных окрашенных пленках, даже если они приготовлены из фиксированного формалином материала, не выявляется клеточная стенка. Обработка клеток дубильной кислотой и окраска кристаллическим фиолетовым делают клеточную стенку видимой, но при этом ширина бактерий больше по сравнению с той, которая характерна для живых клеток в жидкой среде или в окрашенных препаратах после высушивания на стекле. Эта методика не очень хороша для грамотрица-тельных бактерий.

Микроскопические измерения производятся с помощью либо калиброванного окуляра-микрометра, либо филярного микрометрического окуляра. Окуляр-микрометр, состоящий из стеклянного диска, на котором имеется ряд регулярно расположенных условно обозначенных отметок, устанавливается поверх полевой диафрагмы окуляра после отвинчивания верхней части. Объект-микрометр— это стеклянная пластинка, специально размеченная линиями, отстоящими друг от друга ровно на 10 мкм; при наведении на фокус линии окуляра-микрометра накладываются на лини

страница 11
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.04.2017)