Биологический каталог




Методы общей бактериологии. Том 1

Автор Ф.Герхардт

обы охарактеризовать ту или иную бактерию, обычно специфические морфологические детали выявляют с помощью световой микроскопии. Некоторые используемые при этом методы, возникшие еще на заре микробиологической науки, с честью выдержали испытание временем.

Эти классические методы дают самую ценную информацию. Однако важно понимать методологические ограничения, касающиеся деталей формы или структуры, поскольку при любой лабораторной процедуре препарат может подвергаться некоторым изменениям, правда в большинстве случаев незначительным. Как бы то ни было, данные, полученные при микроскопировании бактерий, необходимы, но обычно недостаточны для идентификации последних (гл. 20). Часто, однако, ошибки в идентификации происходят из-за неверных суждений о форме, результатах окраски по Граму или подвижности вновь выделенных форм.

3.1. ВЗЯТИЕ ПРОБ

Наблюдать живые бактерии непосредственно в их естественной среде обитания довольно трудно. К тому же получаемая при этом информация может быть очень неполной. Для этого имеется ряд причин:

1. Не в каждой среде обитания на единицу массы приходится большое количество бактерий. Например, чтобы получить достаточное для изучения количество морских или озерных микроорганизмов, их нужно, как правило, концентрировать пропусканием через целлюлозные или поликарбонатные фильтры или центрифугированием.

2. В некоторых средах содержится слишком много бактерий на единицу массы. Поразительное множество бактерий и других микроорганизмов вперемежку с различными частицами обнаружено в отстое сточных вод или в фекалиях, В данном случае материал нужно разводить одним из многих имеющихся буферов с биполярными ионными свойствами. Некоторые почвы и морские отложения содержат очень мало бактерий, причем эти бактерии смешаны с большим количеством непрозрачного коллоидного вещества, которое с трудом можно отличить от бактерий.

3. Большинство бактерий, составляющих природную флору какой-либо среды, не имеют особых отличительных морфологических признаков. Исключения составляют, например, звездообразный Prosthecomicrobium, снабженный капсулой Sphaerotilus или трихомы рода Caryophanon.

Поскольку бактерии в водной суспензии имеют оптические свойства, сходные со свойствами воды, и их трудно наблюдать с помощью обычного микроскопа в проходящем свете, пробы лучше исследовать с использованием позитивного или негативного фазового контраста или с помощью темнопольной микроскопии. Если последние варианты недоступны, нужно опустить конденсор и уменьшить освещение, чтобы повысить контраст, даваемый обычным микроскопом.

При непосредственной работе с пробами, бактериологическими петлями, предметными стеклами с нанесенными на них капельками и покровными стеклами, а также во время приготовления препаратов в процессе работы с ними существует масса возможностей для бактериального загрязнения пальцев, рабочих поверхностей, одежды и оборудования. Важно соблюдать необходимые предосторожности, уделять внимание мелочам в работе и не забывать об источниках опасности, особенно работая с патогенными микроорганизмами. Помните, что даже фиксированные препараты организмов, содержащих эндоспоры, могут сохранить какой-то уровень жизнеспособности.

К инструментам для взятия бактериальных проб относятся большая петля (диаметром 3 мм), маленькая петля (диаметром 1 мм) и прямая игла для внесения. Они бывают разных типов — платиновые, нихромовые и т. п. (иглы предпочтительно иметь нихромовые); длина их должна быть такой, чтобы после насадки на стеклянную или алюминиевую ручку, ими можно было легко манипулировать при посеве в чашки, отборе материала колоний и внесении в пробирки со средами.

3.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ

Для исследования живых бактериальных клеток разработан ряд методов. При микроскопировании можно использовать культуры, выращенные в жидких средах, однако для получения нужного числа бактерий они нуждаются, как правило, в разведении стерильной средой. Культуры, выращенные на твердых средах, можно суспендировать с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь раствора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения (разд. 2.5.1). Следует помнить, что возраст культуры и физико-химические параметры среды могут быть причиной ненаследуемых (фенотипических) модификаций как внепротоплазматических компонентов (жгутики и капсулы), так и компонентов, находящихся внутри собственно клетки (различные включения); все эти компоненты являются важными признаками, по которым ведется идентификация. Вместе с тем специальные операции или пересевы, производимые в лаборатории, могут благоприятствовать развитию мутантов, имеющих наследственно измененные по сравнению с диким типом черты строения. Изменения могут быть стабильными и нестабильными, но очевидно, что при описании формы и структуры бактерий условия содержания культуры должны быть строго определенными, так как старение культуры и изменения состава среды могут быть причиной ряда морфологических изменений.

Специальные методы исследования растущих культур бактерий были описаны в гл. 2. Ниже мы приводим три метода, которые часто используются при исследовании живых клеток в целях идентификации.

3.2.1. Влажные препараты живых клеток

Для приготовления влажных препаратов одну каплю пробы (около 0,05—0,1 мл) помещают на чистую обезжиренную (предварительным нагревом в течение 20 мин

при 400 °С) поверхность предметного стекла (толщиной 0,8—1,0 мм) и накрывают ее покровным стеклом. Последнее имеет квадратную форму со стороной 22 мм, а толщина его составляет от 0,13 до 0,16 мм (номер 1 или 11/2). Чтобы предотвратить конвекционные токи, смещение или высыхание, зазор между покровным и предметным стеклами герметично заливают васпаром (смесь равных объемов петролатума и парафинового воска), петролатумом, свечным воском (используя фитиль свечи в качестве кисточки для нанесения расплавленного воска в пламени вспомогательной горелки, но не самой свечи) или прозрачного лака для ногтей.

В течение короткого промежутка времени в этих препаратах можно наблюдать подвижность облигатных аэробных бактерий, однако, как только кислород истощится, бактерии прекращают движение. Если ввести в среду небольшие пузырьки воздуха, то их активность продлевается.

Для рассматривания влажных препаратов рекомендуется фазово-контрастная микроскопия, причем для получения наилучших результатов следует использовать как можно более тонкую водную пленку. Кусочек промокательной бумаги, положенный поверх покровного стекла до герметизации, способствует выводу излишнего количества жидкости (так что в препарате остается лишь необходимая для просмотра тонкая пленка) и подсушиванию поверхности потенциальных полей зрения.

Тепло от источника света может нарушить оптимальные движения бактерий. Если наблюдения ведутся в течение длительного периода времени, рекомендуется вставлять тепловой фильтр. Поскольку белый свет может вызывать нарушение подвижности, применяют зеленый светофильтр, лучше других реализующий коррекции, даваемые линзами, и хорошо воспринимаемый глазом наблюдателя. Нагревание пробы предотвращают также с помощью задерживающей оптической вставки, заполненной 5-сантиметровым слоем раствора Мора [50 г сульфата железа и аммония, 1,3 мл 33%-ной (объем/объем) серной кислоты и 250 мл дистиллированной воды].

ЧАСТЬI МОРФОЛОГИЯ

3.2.2. Метод висячей капли

Этот метод заключается в следующем. Каплю пробы помещают в центре чистого покровного стекла, которое затем переворачивают и устанавливают над углублением в специальном предметном стекле так, чтобы капля висела на покровном стекле. Капля должна быть достаточно маленькой, чтобы она не касалась дна углубления. Для герметизации и фиксирования стекла на месте рекомендуется капнуть маленькую каплю воды на край покровного стекла.

Препараты типа «висячая капля» имеют некоторые недостатки, связанные с вогнутостью углубления предметного стекла, кривизной капли и увеличенной толщиной предметного стекла, которая порождает оптические аберрации. Различная глубина фокусировки, требуемая для просмотра пробы от края к центру, затрудняет наведение фокуса на отдельную клетку, особенно если она подвижна; лучше всего фокусировка удается на краю капли. Некоторых трудностей избегают, если используют предметные стекла с лунками, имеющими плоское дно. Тогда их можно заполнить образцом и накрыть покровным стеклом, как описано выше.

3.2.3. Метод висячего агарового слоя

Для приготовления препаратов живых клеток типа «висячая капля» существует хорошее приспособление — пластина из прозрачной пластмассы с высверленным в центре отверстием, имеющим диаметр около 1 см. Покровное стекло с висящей на нем каплей помещают над отверстием, а для того, чтобы стекло удерживалось на месте, на его край наносят каплю иммерсионного масла или воды. Подобным образом к стеклу можно прикрепить тонкий слой агара с растущей культурой или островками колоний, размазанных по стерильной находящейся рядом с ними поверхности. Образуемую отверстием камеру можно закрыть, прикрепив снизу покровное стекло.

3.2.4. Негативное окрашивание

Этот вид окрашивания дает возможность самыми простыми, а зачастую и самыми быстрыми способами получить информацию о преломляющих свет включениях, таких, как сера или гранулы поли-р-оксимасляной кислоты, и о спорах [12]. При его осуществлении взятый петлей 7%-ный (вес/объем) водный нигрозин (или тушь, или конго красный) тщательно перемешивают с бактериальной суспензией на покровном стекле, размазывают смесь до образования тонкой пленки и высушивают на воздухе. Затем кладут покровное стекло на предметное пленкой вниз и фиксируют его положение одной-двумя каплями свечного воска.

В приготовленных подобным образом препаратах, содержащих вместо заливки воздушный слой, бактерии не прокрашиваются и выделяются на темно-синем фоне ярким свечением. В дальнейшем они даже могут быть использованы в работах по изучению характера и степени разрушения клеток (гл. 5), Негативно окрашенные препараты не следует применять для измерени

страница 10
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Методы общей бактериологии. Том 1" (4.60Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.05.2017)