Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

зависят от физического состояния липидов, поэтому спектры фосфолипидов в фазе геля и жидкокристаллическом состоянии существенно различаются [477]. Особенно полезны для регистрации этих различий валентные колебания связи С—С. Например, появление гош-конформеров при плавлении углеводородных цепей приводит к увеличению интенсивности полосы при 1080 см-1. Этот метод показывает, что некоторая доля гош-конформеров сохраняется и в состоянии геля до тех пор, пока температура не снизится до очень низких значений, около - 200° С. Заметим, что колебания часто охватывают всю молекулу, так что количественная интерпретация спектров с точки зрения анализа влияния отдельных коиформации является непростой задачей.

Обычно образцы представляют собой суспензию липидов в концентрации около 1 мг/мл. Мембраны, содержащие хромофоры (на-

68 Глава 2

пример гем) или флуоресцирующие примеси, непригодны для изучения. Фоновая флуоресценция делает невозможным измерение относительно слабых сигналов комбинационного рассеяния, а поглощение хромофорами лазерного излучения приводит к нагреванию

Инфракрасная (ИК) спектроскопия

Этот метод также основан на регистрации колебательных спектров молекул, но до недавнего времени его применение для изучения биологических объектов было ограниченным из-за невозможности работы с водными суспензиями. После разработки современных ИК-спектрометров с фурье-преобразованием многие из этих проблем были решены. В настоящее время опубликовано немало работ по изучению липидных дисперсий и биологических мембран методом фурье-ИК-спектроскопии [190, 32]. Преимущества этого метода перед спектроскопией КР состоят в его значительно более высокой чувствительности, а также в том, что флуоресцирующие примеси или хромофоры не мешают измерениям. Как и в случае спектроскопии КР, фурье-ИК-спектры чувствительны к изменениям полиморф-ио-фазового состояния липидов. Поэтому фурье-ИК-спектроскопия использовалась для изучения предпереходов в фосфатидилхолино-вых бислоях [181], главного фазового перехода гель—жидкий кристалл [180], а также перехода яичного фосфатидилэтаноламина из ламелляриой фазы в гексагональную Нц-фазу [919].

Изменение конформации липидных цепей сопровождается частотным сдвигом полос поглощения групп СНг, причем эти изменения коррелируют с изменением доли гош-коиформеров в цепях. Например, в присутствии холестерола число гош-коиформеров в ди-пальмитоилфосфатидилхолине при температурах выше температуры главного фазового перехода снижается [250], что согласуется с изменениями упорядоченности бислоя, измеренной методом 2Н-ЯМР [1092]. Встраивание в бислой интегрального мембранного белка (см. гл. 5) оказывает совершенно иной эффект: число гош-кон-формеров в жидкокристаллической фазе практически не изменяется, но увеличивается их содержание в фазе геля, поскольку белки мешают ацильным цепям упаковываться в полностью-транс-конфигура-ции [250].

2н-ЯМР

Более детальную картину строения гидрофобной области липидного бислоя удалось получить с помощью метода 2Н-ЯМР [1319, 291]. Атомы водорода в определенных местах липидной молекулы можно избирательно заменить дейтерием. Это сравнительно мяг-

Структура н свойства мембранных липидов 69

12.12

14,14.14

40 000

Рис. 2.13. Спектры Н-ЯМР димиристоилфосфатидилхолина, дейтерированиого по разным положениям ацильной цепи. Числа слева обозначают положение двух (или трех) атомов дейтерия в каждой цепи. Обратите внимание, что спектр образца с дейте-рироваииой концевой метильной группой (14,14,14) гораздо уже всех остальных приведенных спектров, что указывает иа значительную неупорядоченность центральной области бислоя. Рисунок любезно предоставлен д-ром Е. Oldfield.

С ¦мол

с

о

\

"CD

Рис. 2.14. Вектор гмол, характеризующий ориентацию данного сегмента цепи, и вектор rc-D, направленный вдоль связи С—D, которые используются при расчете параметра упорядоченности по данным Н-ЯМР.

70 Глава 2

кий способ зондирования мембран, и считается, что он, как правило, не вносит возмущений в их структуру. Спектры некоторых дей-терированных димиристоилфосфатидилхолинов представлены на рис. 2.13. Расстояние между двумя пиками Avq, называемое квадру-польным расщеплением, зависит от усредненной по времени ориентации вектора С—D-связи по отношению к нормали к бислою (рис. 2.14). Усредненную по времени ориентацию можно выразить через параметр упорядоченности следующим образом:

Scd = 1/2 (3 - 1),

где отражает усреднение ориентации по времени, a Scd является параметром упорядоченности связи. Необходимо подчеркнуть, что результат измерения является величиной, усредненной по всем молекулам.

Для 0 = 0° = 1 и Scd = 1. Для 0 = 90° = 0 и Scd = - 1/2.

При хаотичной ориентации (cos20> = 1/3 и Scd = 0.

В литературе часто используется параметр молекулярной упорядоченности Биол, который характеризует ориентацию вектора, перпендикулярного плоскости, образуемой группой CD2 (рис. 2.14). Этот параметр описывает усредненную ориентацию данного сегмента ацильной цепи:

5М0Л = - 2Scd.

Параметр упорядоченности, получаемый с помощью метода 2Н-ЯМР, отражает усредненную ориентацию и мало что говорит о динамике системы и о характере движений.

Особое значение имеет тот факт, что локальное магнитное поле, в котором находится конкретный атом дейтерия, зависит от ориентации С—D-связи по отношению к внешнему магнитному полю. Колебательные и вращательные движения молекулы, которые влияют на ориентацию С—D-связи в бислое в целом, происходят с достаточно большой скоростью (>106с-1), так что любой атом дейтерия воспринимает единое усредненное магнитное окружение. Это окружение зависит от соседних атомов, а также от ограничений движения по типу и амплитуде. В этом отношении метод 2Н-ЯМР отличается от КР- и ИК-спектроскопии, поскольку переходы транс-и гош- совершаются с гораздо меньшей частотой (109с-1), чем разность частот колебательных полос, отвечающих этим формам (~1012Гц). Поэтому ИК- и КР-спектры дают картину, которую можно назвать моментальной фотографией вклада транс- и гош-ротамеров в спектральные параметры. Для измерения параметров упорядоченности применяют н другие методы, в частности спектроскопию ЭПР и флуоресенцентную спектроскопию. Об этих методах, связанных с использованием зондов, разговор пойдет в гл. 5.

Структура и свойства мембранных липидов 71

I-1-1--i-1_:_i i •

2 6 Ю 14

Положение меченого атома, углерода

Рис. 2.15. Нормированные профили упорядоченности для различных бислоев, иллюстрирующие зависимость параметра молекулярной упорядоченности от положения углеродного атома в ацильной цепи [1321]. Темные кружки — дипальмитоилфосфати-дилхолии, темные треугольники — 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолии, темные квадратики — дипальмнто ил фосфатидилсерин, светлые кружки — мембрана Ac hole-plasma laidlawii.

На рис. 2.15 приведены параметры упорядоченности, определенные по данным 2Н-ЯМР для нескольких селективно дейтерирован-ных фосфолипидов, в которых атом дейтерия включен в определенные метиленовые группы 5л-1-пальмитоильного остатка. Исследовались как липидные бислой, так и природные мембраны, находящиеся в жидкокристаллическом состоянии, поскольку в случае фазы геля спектры очень уширяются из-за плотной упаковки липидов и потому с трудом поддаются анализу. Эти данные позволяют сделать два вывода.

1. Параметр упорядоченности довольно постоянен на участке от С-2 и до примерно С-8 или С-10. Метиленовые группы в средней части бислоя значительно более разупорядочены, чем группы вблизи его поверхности.

2. Для синтетических липидов разных типов, включая фосфати-дилхолин, фосфатидилсерин и сфингомиелин, а также для биологических мембран, содержащих дейтерированные зонды, получен одинаковый профиль параметра упорядоченности. Таким образом, характер упорядоченности бислоя мало зависит от химического строения липида и от состава мембраны, если бислой находится в -жидкокристаллическом состоянии.

Количественный анализ этих данных можно провести на основе молекулярного моделирования с использованием методов статисти-

72 Глава 2

ческой механики (см. работу [921] и обзор [1161]). Например, приведенные результаты согласуются с наличием в каждой цепи дипаль-митоилфосфатидилхолина четырех или пяти гош-ротамеров при очень малом содержании кинков (0,5 кинка на цепь) [1320]. Поскольку каждая цепь закреплена у поверхности бислоя, участок цепи вблизи поверхности наиболее упорядочен. Обратите внимание, что бислой — это высококооперативная система. Ацильная цепь не может изменить свое направление без компенсационных изменений соседних цепей. Поэтому группа смежных сегментов цепи должна двигаться кооперативно. Отклонения ориентации сегментов цепи от нормали к бислою будут усиливаться по мере перехода от поверхности бислоя к его центральной области. Поэтому разупорядочен-ность максимальна в середине бислоя, где подвижность цепей такая же, как в жидком парафине. Данные других методов также показывают, что молекулярная подвижность максимальна в центре бислоя. Но необходимо отметить, что неупорядоченность — это статистический параметр, который ничего не говорит о характере движения. Так, можно иметь сильно неупорядоченную структуру (например, оконное стекло), которая в то же время обладает малой подвижностью (см. гл. 5).

Дифракция нейтронов

Селективно дейтерированные фосфолипиды можно также исследовать методом дифракции нейтронов [1320]. Если рентгеновские лучи рассеиваются на электронах, то нейтроны — на ядрах атомов. Рассеивающие свойства *Н и 2Н сильно различаются, что позволяет выявлять дейтерированные области по кривой плотности рассеяния. Например, судя по данным дифракции нейтронов, атом С-5 находится на расстоянии 15 А от центра дипальмитоилфосфатидил-холинового бислоя в фазе геля; это соответствует полностью вытянутой транс-конфигурации цепей [161]. Используя D2O в качестве растворителя, можно определить локализацию воды в фазе геля; полученные данные показывают, что вода проникает до области локализации глицерольных остатков [1606, 622]. С помощью рассеяния нейтронов можно определить также локализацию ионов, таких, как Са2 + [622] (см. гл. 7).

2.3. Термодинамика полиморфизма липидных структур

Данные, представленные в предыдущем разделе, показывают, что гидратированные липиды обладают структурным полиморфизмом. Во всех липидных структурах неполярные углеводородные области молекул агрегируют, а полярные головки контактируют с во-

Структура и свойства мембранных липидов 73

дой. В этом разделе мы кратко рассмотрим термодинамические принципы образования мицелл амфифильными липидами. Термодинамический анализ будет проводиться с учетом геометрической формы молекул, что позволит с единых позиций рассмотреть такие разные вопросы, как механизм разрушения мембран под действием детергентов и механизм влияния холестерола на фосфолипидный бислой.

2.3.1. ГИДРОФОБНЫЕ СИЛЫ [1432]

С точки зрения термодинамики основной силой, стабилизирующей гидратированные липидные агрегаты, являются гидрофобные взаимодействия. К другим стабилизирующим факторам относятся:

1. Вандерваальсовы силы: короткодействующие слабые силы притяжения между соседними гидрофобными цепями. Притяжение возникает за счет взаимодействия между индуцированными диполями.

2. Водородные связи: образуются между полярными головками некоторых липидов (например, между молекулами фосфатидилэтаноламина) [115]. В ряде случаев мостики между отрицально заряженными липидами образуются с помощью двухвалентных катионов.

Все эти силы по своей стабилизирующей способности значительно уступают гидрофобным взаимодействиям. Под действием гидрофобных сил система принимает такую структурную организацию, при которой сводятся к минимуму контакты между неполярными участками липидных молекул и водой. Эти силы имеют энтропийную природу и связаны с ограничениями, налагаемыми на упаковку молекул воды вокруг неполярных углеводородов.

Динамическая структура чистой воды весьма сложна, однако ясно, что она стабилизируется прежде всего межмолекулярными водородными связями [1392]. Когда какой-либо ион, например С1~, попадает в воду, он сольватируется, при этом молекулы воды образуют вокруг него гидратную оболочку. С точки зрения энтропии упорядочение молекул воды невыгодно, но это с избытком компенсируется сильными электростатическими взаимодействиями, так что суммарное изменение свободной энергии при растворении соли в воде оказывается термодинамически выгодным. Когда в воде растворяется неполярное вещество, структура воды вокруг каждой молекулы также нарушается. Молекулы воды стремятся ориентироваться таким образом, чтобы сохранились межмолекулярные водородные связи (каждая из них дает около 5—7 ккал/моль), но поскольку те молекулы воды, которые непосредственно контактируют с молекулами растворенного неполярного вещества, соседствуют с меньшим число молекул воды, в системе возникают зна-

74 Глава 2

чительные структурные напряжения. Это приводит к уменьшению энтропии системы, причем в данном случае компенсирующие электростатические взаимодействия отсутствуют. В результате суммарное изменение свободной энергии при переносе иеполярного вешества из неполярного растворителя (например, гептана) в воду термодинамически неблагоприятно из-за энтропийных эффектов, связанных с нарушением структуры воды как растворителя. Аналогией водных систем с растворенными в них неполярными молекулами могут служить кристаллогидраты неполярных молекул или атомов (например, аргона), в которых вода образует решетки или клатраты, окружающие «растворенное» вещество [460].

Невыгодные взаимодействия между неполяриым растворяемым веществом и водой — это и есть «гидрофобные силы». С помощью термодинамических измерений можно количественно оценить стремление неполярных веществ минимизировать контакты с водой. Гидрофобные силы являются главным фактором стабилизации практически всех биологических макромолекулярных структур, включая глобулярные белки, а также фосфолипидный бислой. «Гид-рофобность» таких простых молекул, как углеводороды, можно количественно оценить по данным равновесного распределения растворяемого вещества (скажем, этана) между двумя растворителями, например водой и гептаном.

Выразим концентрацию растворенного вещества в воде и в углеводороде в мольных долях, [Х]Нг0 и [Х]нс Тогда константа равновесия К будет равна

[Х]Н2о

= К, (2.1)

[Х]нс

-КГЫК= ДО°еренос = 0*й2о - мне). (2.2)

Стандартная свободная энергия переноса вещества из одной фазы в другую, ДСперенос, является мерой его гидрофобности [1432]. Показано, что гидрофобность пропорциональна площади поверхности контакта между водой и неполярным растворенным веществом [1212]. Чем крупнее молекула (например, молекула углеводорода с длинной цепью), тем значительнее нарушения структуры воды из-за увеличения площади контакта. Как видно из рис. 2.16, гидрофобность углеводородов возрастает пропорционально площади их поверхности. Используя вандерваальсов радиус для расчета площади поверхности контакта между молекулами воды и углеводородами, подсчитали, что AG%tpeao(:

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.08.2017)