Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

части диаграммы представлены смеси с высоким содержанием липида, справа — разбавленные дисперсии липосом. Указаны ламеллярная гелевая фаза (La ), ламеллярная жидкокристаллическая фаза (L„) и промежуточная рифленая фаза (Рц). При высокой температуре и низкой гидратации могут образовываться другие фазы — Q„ (кубическая фаза) и На (гексагональная фаза). Пунктирная линия — граница максимальной адсорбции воды с образованием гомогенной водно-липидиой смеси.

60 Глава 2

Рнс. 2.7. Электронные микрофотографии препаратов, полученных методом замораживания—травления [1269]. Видна текстура гелевой (Lfl ), рифленой (Рв) и жидкокристаллической фаз изолированных фосфатидилхолииов. А. Дипальмитоилфос-фатидилхолин при 25 °С. Б. Дипальмитоилфосфатидилхолин при 35 °С. В. Димири-стоилсфатидилхолин при 25 "С. Фотографии любезно предоставлены д-ром Е. Sackmann.

На рис. 2.6 приведена фазовая диаграмма для дипальмитоилфос-фатидилхолина [1269]. Этот липид существует в ламелляриой форме при самых разных условиях. При добавлении воды он «набухает» до тех пор, пока между слоями не скопится максимально возможное количество воды. В этой точке образуется двухфазная система, представляющая собой взвесь мультиламеллярных липосом. Обратите внимание, что между фазой геля (Цу) и жидкокристаллической ламелляриой фазой (La) имеется еще одна фаза. Это так называемая «рифленая» фаза (Р^.). В этой фазе поверхность бислоя на электронных микрофотографиях имеет волнообразный вид (рис. 2.7). Температурный фазовый переход Рд, -* La называется главным, а переход Ц, -* Р0, — предпереходом (разд. 2.4).

Липиды, имеющие объемные полярные головки (например, фос-фатидилхолин), обычно претерпевают предпереход, свидетельствующий о наличии фазы, промужеточной между гелевой и жидкокристаллической [604]. В Рв,-фазе дипальмитоилфосфатидилхо-лина ацильные цепи, вероятно, наклонены [461], хотя спектры комбинационного рассеяния [181] говорят о том, что они по-прежнему, как и в фазе геля, находятся преимущественно в полностью-транс-конфигурации (разд. 2.4).

2.2.3. ДВА МЕТОДА ИЗУЧЕНИЯ ЛИПИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА

Кроме метода дифракции рентгеновских лучей для характеристики свойств липидных фаз использовали и другие методы. Один из них, оказавшийся особенно полезным, — это электронная мик-

Структура и свойства мембранных липидов 61

роскопия замороженных сколов. Второй метод, 31Р-ЯМР, был введен в исследовательскую практику несколько позже и нашел применение для обнаружения небислойных структур, которые, как полагают, играют особую роль в биологических мембранах [1507, 264].

1. Электронная микроскопия липидных фаз с применением метода замораживания—травления. Этот метод оказался очень полезным при изучении структурной организации различных липидных фаз (см. гл. 1 и работы [263, 313, 1509, 783]). Примеры получаемых при этом электронных микрофотографий приведены на рис. 2.7. Жидкокристаллическая фаза (La) на этих микрофотографиях всегда выглядит как гладкая поверхность, а Р^.-фаза — как рифленая. Геле-вая фаза (Ц.) выглядит как гладкая поверхность, но при определенных условиях приготовления препарата имеет спиральную текстуру из-за возникновения случайных дефектов в плотной упаковке Гексагональная фаза (Нц), образуемая такими липидами, как ненасыщенный фосфатидилхолин, выяляется на микрофотографиях после замораживания—травления (рис. 2.8) как стопка цилиндров. При приготовлении образцов липиды уравновешивают в условиях, подходящих для формирования нужных структур, а затем быстро замораживают, чтобы организация этих структур не успела измениться.

Рис. 2.8. Характеристика различных фаз, образуемых фосфолипидами, по данным "Р-ЯМР и электронной микроскопии (замораживание—травление) [263). Обратите внимание, что ламеллярная жидкокристаллическая фаза L„ и гексагональная фаза Нц имеют существенно разные спектры "Р-ЯМР и по-разному выглядят на электронных микрофотографиях. Бислойная структура получена из яичного фосфатидилхолина, а гексагональная фаза — из фосфатидилхолина соевых бобов. Узкие линии в спектре "Р-ЯМР, свидетельствующие о быстром движении молекул, чаще всего наблюдаются либо для малых моиоламелляриых везикул (фото 1), либо для больших липидных структур, содержащих «липидные частицы» (фото 2). Фотографии любезно предоставлены д-ром P. Cullis и д-ром М. Норе.

62 Глава 2

отношение) [263]. Препарат получен методом замораживания—скалывания. Внизу представлена модель липидной частицы, предполагающая, что она имеет форму вывернутой мицеллы. Заштрихованная область — место скола. Рисунок любезно предоставлен д-ром P. Cullis и д-ром М. Норе.

Электронно-микроскопические методы использовались также для изучения «липидных частиц» (рис. 2.9). Эти частицы нередко наблюдаются в бинарных смесях, если один из липидов склонен образовывать фазу Ни, а другой — бислойные структуры [263, 1507, 1508]. Липидные частицы образуются в чисто липидных образцах и потому отличаются от «белковых частиц», которые наблюдаются в биологических мембранах и в реконструированных белково-липид-ных системах (см. рис. 1.6). Было высказано предположение, что липидные частицы представляют собой вывернутые мицеллы, расположенные внутри бислоя, и что они играют определенную роль в биологических процессах, облегчая слияние мембран или стабилизируя их на сильно искривленных участках, как, например, в мем-бране тилакоидов [263, 1507, 1041, 533]. Однако четких доказательств биологической роли липидных частиц пока не получено.

2. Исследование бислоев методом ЪХР-ЯМР [1454]. Этот метод также используется для структурной характеристики гидратирован-ных липидов [263, 1318, 264, 266, 487, 748]. Например, фосфолипи-

Структура и свойства мембранных липидов 63

ды в гексагональной фазе Ни дают спектры 31Р-ЯМР, резко отличающиеся от спектров фосфолипидов в ламеллярной фазе [266, 487] (рис. 2.8). С помощью этого метода исследовался переход ламеллярной фазы в гексагональную в липидах и липидных смесях [487, 748]. Недостатком метода является некоторая неопределенность при интерпретации спектров в случае изотропного усреднения за счет относительно быстрых движений. Полагают, что такой спектр отвечает структурам типа «липидных частиц», однако это объяснение не является единственно возможным. Как было показано, метод 31Р-ЯМР позволяет надежно установить наличие гексагональной Нц-фазы в чисто липидных дисперсиях, но в случае биологических мембран к подобным выводам следует относиться с осторожностью, особенно если они не подтверждены другими методами.

Метод 31Р-ЯМР оказался весьма полезным при определении ориентации и динамического поведения полярных головок фосфолипидов, а также структурных возмущений, вносимых в бислой мембранными белками (см. следующий раздел и гл. 5).

2.2.4. ОРИЕНТАЦИЯ ПОЛЯРНЫХ ГОЛОВОК ЛИПИДОВ В БИСЛОЕ [604, 1320]

Данные ряда методов свидетельствуют о том, что в ламелляр-ных водно-фосфолипидных дисперсиях, как и в липидных кристаллах, полярные головки липидов в целом ориентированы параллельно плоскости бислоя (разд. 2.1). В случае фосфатидилхолинов такая ориентация присуща как гелевой, так и жидкокристаллической фазам, судя по результатам исследований методами дифракции нейтронов и рентгеновских лучей. Об этом же свидетельствуют и данные, полученные методом 2Н-ЯМР, хотя при этом не исключаются и другие интерпретации. Имеющиеся данные указывают на то, что пространственное расположение полярных головок фосфа-тидилглицерина, сфингомиелина и фосфатидилсерина сходно. Исследования методом 2Н-ЯМР интактных фибробластов мыши и выделенных из них мембран также показали, что полярные головки как фосфатидилхолина, так и фосфатидилэтаноламина ориентированы параллельно поверхности мембран [1293]. Однако по данным дифракции нейтронов у фосфатидилглицерола, выделенного из Е. coli, полярная головка ориентирована примерно под углом 30° к поверхности мембраны, что облегчает связывание отрицательно заряженных фосфатных групп с катионами [995].

На ориентацию и динамику полярных головок липидных молекул может влиять образование межмолекулярных водородных связей на поверхности мембраны [115]. Донорами и акцепторами при Образовании этих связей могут служить такие липиды, как фосфа-

64 Глава 2

тидилсерин, фосфатидилэтаноламин и различные гликолипиды. Исследования, проведенные на модельных мембранных системах, показывают, что водородные связи между полярными головками сохраняются даже в условиях гидратации мембранной поверхности, однако пока неизвестно, как образование этих связей может сказаться на структуре биологических мембран.

2.2.5. КОНФИГУРАЦИЯ И УПАКОВКА АЦИЛЬНЫХ ЦЕПЕЙ В БИСЛОЕ

Рассмотрим сначала насыщенные углеводородные цепи. В них возможно свободное вращение вокруг каждой С—С-связи, характеризующееся энергетическим минимумом, особенно четким в случае ньюменовской проекции (рис. 2.10). Наиболее стабильна транс-конфигурация, при этом высота энергетического барьера для перехода через заслоненную конфигурацию в гош-форму составляет по оценкам 3,5 ккал/моль. В полностью /и/таис-конфигурации цепь максимально вытянута и не меняет своего направления, тогда как в гош-конформации ее направление меняется. Последовательность гош-транс-гош для трех смежных С—С-связей приводит к появлению в цепи излома (кинка), в результате чего участки цепи выше и ниже места излома оказываются значительно смещенными друг относительно друга (рис. 2.11). /"Ьш-конфигурация в зависимости от направления вращения при переходе от Q к С4 обозначается как g+ или g~ (см. рис. 2.10). Кинки типа g+ tg~ или g~ tg+ приводят к минимальному сдвигу цепи. Почти все двойные связи в мембранных липидах находятся в i/ыс-конфигурации. Как и в случае гош-конфигурации, это приводит к изменению общего направления цепи. Наличие в углеводородных цепях кинков, двойных ^«с-связей,

Рис. 2.10. Профиль потенциальной энергии вращения вокруг связи С—С в алкане [535]. Внизу представлены ньюменовские проекции для гош- и /лранс-конфигураций бутана с минимальной энергией: g*, g~ и l.

Структура и свойства мембранных липидов 65

циклопропановых групп [352] и других особенностей приводит к увеличению площади поперечного сечения цепи (минимальное ее значение составляет около 19 А2 при полностью-тронс-конфигура-ции); это может иметь важные последствия для упаковки липидов в бислое. При этом стерические требования к упаковке углеводородных цепей и полярных головок такие же, как и в липидных крастал-лах (разд. 2.1). Эти принципы будут обсуждаться в разд. 2.3 при анализе формы мицелл.

Многие методы, включая дифракцию рентгеновских лучей и нейтронов, спектроскопию КР и ИК-спектрометрию, указывают, что в фазе геля насыщенные углеводородные цепи фосфолипидов находятся преимущественно в полностью-гпранс-конфигурации [604, 1320]. Минимальная площадь поперечного сечения молекулы диа-цильного фосфолипида равна около 38 А2 (2D на рис. 2.2). Примерно такую площадь занимает полярная головка фосфатидилэтаноламина, поэтому насыщенные фосфатидилэтаноламины в гелевой фазе упаковываются так, что ацильные цепи располагаются перпендикулярно плоскости бислоя, как и в липидных кристаллах. В случае же кристаллов фосфатидилхолина [605, 1133] минимальная площадь, приходящаяся на одну полярную головку, составляет примерно 50 А2. Поэтому дипальмитоилфосфатидилхолин в гелевой фазе не может упаковываться так, как фосфатидилэтаноламин. В этом случае ацильные цепи дипальмитоилфосфатидилхолина отклоняются на 30° от нормали к бислою, благодаря чему их поперечное сечение увеличивается и достигается соответствие размеру полярной головки. При этом углеводородные цепи сохраняют полнос-тью-транс-конфигурацию. В жидкокристаллической фазе появление в цепи гош-конформеров увеличивает эффективное поперечное сече-

66 Глава 2

Число углеродных атомов в цепи

Рис. 2.12. Зависимость толщины углеводородной части бислоя, измеренной по данным рассеяния рентгеновских лучей, от числа углеродных атомов в цепи [848}. Счет углеродных атомов ведется от положения С-2 в каждой цепи. Для измерений использовались днацилфосфатидилхолины в жидкокристаллическом состоянии. Точки — насыщенные цепи, квадратики — моионеиасыщенные ацильные цепи. Площадь, приходящаяся на молекулу, составила от 65 до 70 А1.

ние цепей по меньшей мере до 50 А2 в расчете на молекулу диациль-ного фосфолипида, а в водных дисперсиях эффективная площадь, приходящаяся на молекулу фосфолипида, составляет обычно 60 — 70 A2 [604J. Следовательно, в жидкокристаллической фазе углеводородные цепи не наклонены к плоскости бислоя, поскольку в этих условиях.полярные головки липидных молекул достаточно удалены друг от друга, и чтобы заполнить пространство между соседними головками и перекинуть между ними мостики, требуются вода и другие полярные молекулы. Судя по данным 2Н-ЯМР, толщина углеводородной области дипальмитоилфосфатидилхолинового бислоя в жидкокристаллическом состоянии составляет 35, а не 45 А, как следовало ожидать, если бы цепи находились в полностью-транс-конфиругации и были ориентированы вдоль нормали к би-слою [1320]. Толщина бислоя уменьшается за счет наличия к цепях гош-конформеров, приводящих к разупорядоченности цепей, причем сами цепи в целом растянуты и расположены перпендикулярно поверхности бислоя, а не скручены в спираль. На рис. 2.12 приведена линейная зависимость толщины жидкокристаллического бислоя в диацилфосфатидилхолиновых везикулах от длины ацильных цепей, построенная по данным рассеяния рентгеновских лучей [848].

Структура и свойства мембранньгх липидов 67

2.2.6. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГИДРОФОБНОЙ ОБЛАСТИ БИСЛОЯ

Для получения детальной картины строения внутренней области бислоя особенно полезными оказались два метода: Н-ЯМР и ИК-и КР-спектроскопия. Применение *Н- 13С-ЯМР для исследования мембран и водно-липидных систем затруднено, поскольку для получения пригодных для исследования малых везикул или мембранных фрагментов необходима предварительная фрагментация мембранного препарата с помощью ультразвука. Впрочем, если вращать образец под магическим углом, то необходимость в такой обработке отпадает, и это открывает новые возможности для более широкого применения последних методологических достижений ЯМР при изучении модельных и биологических мембран [1093].

Применение методов 2Н-ЯМР и колебательной спектроскопии не сопровождается возмущениями бислоя, поскольку в этих методах не используются зонды, которые могли бы исказить структуру окружающих их липидов. Ниже приведены краткое описание этих методов и сводка результатов, полученных при изучении конфигурации ацильных цепей. Применение зондов для изучения мембран методами ЭПР или флуоресценции будет обсуждено в гл. 5 в связи с исследованиями динамики мембран и липидно-белковых взаимодействий.

Спектроскопия комбинационного рассеяния (КР)

Лазерная спектроскопия комбинационного рассеяния оказалась весьма полезной для изучения физического состояния модельных и биологических мембран (см. обзоры [1513, 1544]). Этот метод основан на измерении разности энергии падающего света и света, рассеянного за счет колебательных движений. Тип колебаний и их интенсивность очень сильно

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.06.2017)