Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

[1288]; во всяком случае, как было показано на модельных опытах, его не обязательно привлекать для объяснения кинетики переноса белков in vivo [1196]. Одна из вероятных функций СРЧ состоит в предотвращении неправильного свертывания образующегося полипептида, которое может блокировать перенос (например, из-за экранирования сигнальных последовательностей). Задержка трансляции должна уменьшать вероятность такого ошибочного свертывания и, следовательно, увеличивать эффективность переноса белков.

496 Глава 10

Образовавшаяся цепь

ме м Spa нес в я за нкь ш сигнальный рецептор (часть канала 77)

Ш Образовавшаяся цепь (2) СРЧ связывается с кем- (з) Сигнальный пептид

связывается с СРЧ с obpu - браносвязанным СРЧ- перемещается к пем-

зованием растворимого рецептором (стыковочный браносвязанному сигналь -

комплекса СРЧ/рибосома/ белок) ному рецептору

обра 'свидится цепь

Рис. 10.15. Схематическое изображение ранних стадий котрансляционного переноса полипептида через эндоплазматический ретикулум млекопитающих. Сигнал-распознающая частица и СРЧ-рецептор (стыковочный белок) хорошо охарактеризованы. Мембраносвязанный сигнальный рецептор изображен как компонент канала через мембрану, но существование таких каналов и роль сигнального рецептора не бесспорны. После образования комплекса между сигнальным пептидом и мембраносвязан-ным рецептором на стадии 3 СРЧ и стыковочный белок могут диссоциировать и принимать участие в новом цикле, оставляя мембраносвязанную рибосому и образовавшуюся цепь присоединенными к аппарату переноса.

Некоторые небольшие белки (<8,5 кДа) транспортируются в эндоплазматический ретикулум независимо от СРЧ. В их число входят препропептид GLa лягушки [1297], препромелиттин [1033] (оба они являются предшественниками секретируемых белков) и пробелок оболочки фага М13 [1577]. Во всех этих примерах конформация предшественника такова, что белки должны оставаться способными к переносу даже в отсутствие СРЧ и рибосом [1033].

2. Рецептор СРЧ, или стыковочный белок. Комплекс СРЧ/ рибосома/образующаяся полипептидная цепь транспортируется в шероховатый эндоплазматический ретикулум, преодолевая энергию сильного взаимодействия между СРЧ и мембраносвязанным рецептором СРЧ, называемым также стыковочным белком [656, 823,1419]. Рецептор СРЧ содержит субъединицу с мол. массой 73 кДа, присоединенную N-концом к мембране. Вероятно, рибосома также связывается со специфическими рецепторами, присутствующими в мембране [1620].

Биогенез мембран 497

3. Рецептор сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность на образующейся полипептидной цепи перемещается от СРЧ ко второму рецептору, находящемуся в мембране и называемому рецептором сигнальной последовательности [1578, 1547]. Об этом свидетельствуют результаты опытов по фотохимическому сшиванию, в которых используется метка, связанная с сигнальной последовательностью препролактина. Предполагаемый мембраносвязанный рецептор представляет собой гликопротеин с мол. массой 35 кДа. Возможно, он образует часть канала, через который осуществляется перенос. С помощью такого же подхода с использованием поперечной сшивки и синтетического сигнального пептида был обнаружен еще один кандидат на роль рецептора сигнальной последовательности (45 кДа) [1233]. Связь между этими двумя белками неизвестна и функции их до конца не установлены. Как только образовавшаяся полипептидная цепь связывается с мембраносвязанным рецептором, СРЧ и ее рецептор могут освободиться от рибосомы и принять участие в новом цикле. О предполагаемом канале, участвующем в переносе, ничего не известно; очистка его является довольно сложной задачей.

Было показано, что для переноса белков через эндоплазматический ретикулум дрожжей необходимы растворимые факторы [589, 1556], однако их сходство с СРЧ не установлено. Перенос различных секретируемых белков в дрожжах может происходить после завершения трансляции, поэтому не исключается, что в этих случаях образующиеся полипептидные цепи взаимодействуют с мембраносвязанным рецептором сигнальной последовательности [1547]. По-видимому, растворимые белковые факторы необходимы и для экспорта белков в Е. coli [1034], а также для импорта белков в митохондрию [1152], но охарактеризовать их не удалось. Было показано, что продукт гена secY, необходимый для экспорта белков в Е. coli, является мембраносвязанным, но его функция остается неизвестной [Ю].

Определенные успехи были достигнуты при идентификации рецептора на наружной митохондриальной мембране, необходимого для импорта белков. Опыты по связыванию с порином показали, что на мембране имеется некий рецептор с высоким сродством (константа диссоциации -10 8 М), который участвует в импорте ADP/ATP-переносчика, белка внутренней мембраны [1147]. Идентифицированы два разных полипептида — компонента рецептора сигнальной последовательности наружной мембраны [513, 1089]. При этом использовались два метода: блокирование импорта белков ан-тителами[1089] и химическое сшивание с синтетическим сигнальным пептидом [513]. Интересно, что импорт в митохондрии, по-видимому, не связан с наружной мембраной, которая удаляется при образовании митопластов. Это наблюдение позволяет предполо-

498 Глава 10

жить, что другой рецептор сигнальной последовательности находится во внутренней мембране [1088].

10.3.5. СБОРКА МУЛЬТИСУБЪЕДИНИЧНЫХ КОМПЛЕКСОВ И ОБНОВЛЕНИЕ МЕМБРАННЫЗ БЕЛКОВ

После встраивания мембранного полипептида в мембрану он еще должен приобрести правильную конформацию, обеспечивающую его биологическую активность, а если речь идет о мультнсубъ-единичных комплексах, то связаться с другими белками. В частности, у эукариот при этом должны произойти различные ковалент-ные модификации, например гликозилирование, ацилирование, сульфирование или образование дисульфидных связей. Даже когда такие модификации не являются необходимыми, процесс конформацион-ного созревания может быть медленным и отстоять по времени от встраивания в мембрану.

Например, у Е. coli четко наблюдается сборка стабильных тримеров обоих белков, LamB [1533] и OmpF [66], после включения соответствующих мономеров в наружную мембрану, при этом созревание LamB занимает около 5 мнн. В эукариотических клетках гли-копротеин гемагглютннииа вируса гриппа, прежде чем попасть из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, должен сформировать правильную четвертичную структуру, соответствующую зрелой форме [509]. Несвериутые молекулы гемагглютинина остаются в эндоплазматическом ретикулуме. Образование тримеров занимает примерно 7—10 мни [509]. Сходная олигомеризация наблюдается также для G-белка вируса везикулярного стоматита [785].

Сборка многих мультисубъединичных комплексов, содержащих разные субъединицы, тоже, по-видимому, происходит в эндоплазматическом ретикулуме. Примером служит никотиновый ацетилхолиновый рецептор [1359], который содержит две а-субъединицы и по одной /3-, у- и 6-субъединице (рис. 8.8). С помощью антител можно различить отдельные формы а-субъединицы: 1) начальный продукт, встраивающийся в эндоплазматический ретикулум; эта форма не может связывать антагонист а-бунгаротоксин; 2) форма, способная связываться с а-бунгаротоксином и образующаяся через несколько минут после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 3) зрелый рецептор, содержащий все субъединицы (агРуб), который обнаруживается через 15 мин после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 4) готовый рецептор на клеточной поверхности, появляющийся спустя примерно 2 ч после трансляции. Созревание включает образование дисульфидных связей, олигосахаридный процессинг и ацилирование при участии

Биогенез мембран 499

жирных кислот. Вероятно, определенную роль в сборке, происходящей в комплексе Гольджи, играет фосфорилирование субъединиц [1243].

Решающим фактором процесса сборки является, вероятно, стабильность таких стехиометрических комплексов, как ацетилхолиновый рецептор. По-видимому, в некоторых системах отдельные субъединицы синтезируются в значительном избытке и не образуют стабильных комплексов, а подвергаются протеолитическому расщеплению [887]. Об этом свидетельствуют результаты, полученные при изучении некоторых мультисубъединичных комплексов, в частности Т-клеточного рецептора антигена [994].

Изучался также процесс созревания и сборки структуры, образующей Na-канал [1300]. Необходимым условием созревания является образование дисульфидной связи между а- и /Зг-субъединицами (разд. 8.2.5), однако это событие происходит спустя примерно 1 ч после трансляции и транспорта субъединиц в аппарат Гольджи, а рецептор появляется на клеточной поверхности чере:> 4 ч после трансляции. В этом случае свободные а-субъединнцы не подвергаются быстрой деградации, а сохраняются в межклеточном пуле и, возможно, используются в дальнейшем в качестве предшественников для формирования канала в растущих нейронах.

Созревшие мембранные белки подвергаются непрерывному обновлению. Период полуобновления Na-канала составляет около 30 ч [1300], что типично для поверхностных белков. Обновление большой субъединицы Na/K-АТРазы в растущих клетках в культуре происходит за время 20 — 40 ч [727, 1429]. По-видимому, деградация по крайней мере некоторых белков происходит в лизосомах. В качестве примера можно привести цитохром Р450, содержащийся в эндоплазматическом ретикулуме [931].

Дополнение 10.3. Два интересных примера

обновления мембранных белков

Стабильность белков в клетке определяется множеством различных факторов [1205]. Особенно интересным примером деградации мембранных белков является гидроксиметилглутарил-СоА-редуктаза [512, 768]. Этот фермент находится в гладком эндоплазматическом ретикулуме и регулирует эндогенный синтез холестерола. Деградация его происходит довольно быстро (- 2—4 ч) и ускоряется при взаимодействии с холестеролом. Для ускорения процесса необходимо наличие мембраносвязанного домена фермента [512]. При определенных условиях в культуре ооцитов китайского хомячка наблюдается сверхпродукция (более 500 раз) этого фермента. В

500 Глава 10

результате образуются мембранные трубочки, занимающие 15% клеточного объема и содержащие другие мембранные белки, а также липиды [768]. Добавление холестерола приводит к быстрой деградации избытка мембран, что говорит о координации синтеза и деградации мембранных компонентов.

Другим интересным примером селективного метаболизма мембранных белков является гербицидсвязывающий белок (называемый также белком D1 или Qb) с мол. массой 32 кДа из тилакоидов хлоропластов. Этот белок синтезируется как предшественник, созревая внутри отдельных ламелл тилнкоида, не собранных в граны, и является частью фотосистемы II в ламеллах, входящих в граны [940]. На свету скорость деградации этого полипептида в мембране намного выше, чем других белков [630]. Причина этого явления неизвестна; возможно, оно связано с тем, что в фотосистеме II на свету происходят какие-то повреждения.

10.4. Биосинтез и распределение мембранных липидов [298]

Как мы отмечали в гл. 1, в мембранах эукариотических клеток обнаружено огромное количество разных липидов, причем они не распределены равномерно по разным клеточным мембранам. Эта неравномерность относится к распределению как полярных головок (табл. 1.3), так и ацильных хвостов (табл. 1.6). Например, степень ненасыщенное™ фосфолипидов в общем случае уменьшается при переходе от эндоплазматического ретикулума к комплексу Гольджи и затем к плазматической мембране [298]. Для животной клетки среднее молярное отношение холестерол/фосфолипиды равно 0,3— 0,4, при этом для плазматической мембраны оно гораздо выше (0,8—0,9), чем для других мембран, таких, как шероховатый эндоплазматический ретикулум (около 0,1). Кроме того, для многих мембран характерно неравномерное распределение липидов и по разным половинам бислоя (см. гл. 4).

Вопрос о механизме создания и поддержания такой асимметрии очень интересен и сложен. Напомним, что многие мембраны эукариотических клеток участвуют в эндоцитозе и экзоцитозе, при которых от одних мембран везикулы отпочковываются, а с другими сливаются. Этот процесс селективен для белков, которые транспортируются с помощью везикул, но почему-то не приводит к идентичности липидного состава вовлекаемых в него мембран. Причина этого явления неизвестна, выяснены лишь некоторые его аспекты. Рассмотрим, где синтезируются мембранные липиды, а затем обсудим, как они могут транспортироваться к месту назначения.

Биогенез мембран 501

10.4.1. ГДЕ СИНТЕЗИРУЮТСЯ МЕМБРАННЫЕ ЛИПИДЫ? [298, 1498, 1235]

Прокариоты

У Е. coli весь синтез фосфолипидов протекает в плазматической мембране [1235]. В общих чертах этот процесс представлен на рис. 10.16. Жирные кислоты синтезируются в виде предшественников, ковалентно связанных с белком — переносчиком ацила, а затем включаются в мембрану путем ацилирования с образованием CDP-диацилглицерола. Два ацилирующих фермента (рис. 10.16) проявляют предпочтение к ненасыщенным жирнокислотным группам, находящимся в положении sn-2. На уровне CDP-диацилглицерола происходит разветвление процесса, после чего образуется фосфатидилсерин или фосфатидилглицерол (рис. 10.16).

c-s-acp r2—с—s—аср

oocr, I r-oocr,

(р) V^00^

но

r, - 16 0(89%) 16 1 (1%) 18 1 (10%)

160(10%) 16 1 (52%) 18 1 (38%)

r,coo

-стр

CDP-Диацил-oocr, глицерол

смр

5^ ¦> -смр смр-

Фосфа та ди лсери н Фос фапшдилглицгрил- (р)

со, ->

Фоссритидилутанр, ¦ амин

Фосфатидилгпи ¦ 2о° церал_

ГлицерОЛ -*>

г Фосфатидил-слицерол

Нардиолипин 5я,

Рис. 10.16. Общая схема биосинтеза липидов у Е. coli [1235]. На уровне CDP-диацилглицерола происходит разветвление пути и синтезируется либо фосфатидилэтаноламин, либо фосфатидилглицерол и кардиолипин. Указано содержание липидов в мембране (в %). Заметим, что фосфатидная кислота и фосфатидилсерин являются необходимыми интермедиатами, но не накапливаются в клетках дикого типа. Реакции катализируются следующими ферментами: стадия /, sn-глицерол-З-фосфатацилтрансфе-раза; стадия 2, 1-ацил-^л-глицерол-З-фосфатацилтрансфераза; стадия 3, CDP-диацил-глицеролсинтаза; стадия 4, фосфатидилсеринсинтаза; стадия 5, фосфатидилглицерол-фосфатсинтаза; стадия 6, фосфатидилсернндекарбоксилаза; стадия 7, фосфатидилгли-церолфосфатфосфатаза; стадия 8, кардиолипинсинтаза.

502 Глава 10

Механизм регуляции равновесного соотношения между фосфолипидами почти не изучен. В штаммах, в которых фермент, необходимый для биосинтеза кардиолипина, синтезируется в количествах, в 10 раз превышающих норму, наблюдается лишь незначительное увеличение содержания этого фосфолипида в мембране [1091]. Аналогичные результаты были получены для фосфатидилсеринсинтазы (стадия 4 на рис. 10.16) и фосфатидилглицеролфосфатсинтазы (стадия 5 на рис. 10.16) [687]. Сверхпродукция этих ферментов оказывает лишь небольшое влияние на фосфолипидный состав мембраны. С другой стороны, полное отсутствие фосфатидилглицеролфосфат-синтазы губительно для клетки, вероятно, потому, что кислые фосфолипиды необходимы для обеспечения предшественниками других биосинтетических реакций или уч

страница 71
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.04.2017)