Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

одхода удается использовать только в том случае, если вся информация, определяющая локализацию конечного продукта, заключена в первичной последовательности сигнала и если «белок-пассажир» является нейтральным участником процесса и, что существенно, подчиняется сигналу. Это условие выполняется во многих случаях [1291], но известны и такие примеры, когда эффективность переноса [1497, 1554, 798] или даже конечная локализация [689] зависят от «белка-пассажира». Если «белок-пассажир» находится в коиформации, не способной к переносу, то может происходить блокирование переноса химерного белка. Кроме того, функция некоторых сигнальных последовательностей зависит от их локализации в полипептиде илн от взаимодействий с другими участками полипептидной цепи [234, 51, 1345, 365]. Несмотря на все эти трудности, удалось получить много ценных данных о разнообразии сигнальных последовательностей (табл. 10.1).

Сигнальная последовательность, определяюцая встраивание в эндоплаэматический ретикулум [1528]

У большинства белков, встроенных в мембрану эндоплазматиче-ского ретикулума или пересекающих ее, на N-конце имеется «корот-коживущий» сигнальный пептид (от 15 до 30 аминокислотных остатков). Эта сигнальная последовательность непосредственно взаимодействует по крайней мере с двумя рецепторами, один из которых растворим (сигнал-распознающая частица), а другой находится в мембране [1312, 1547, 1578] (разд. 10.3.4). Можно было бы ожидать, что аминокислотная последовательность этого сигнального

476 Глава 10

пептида будет очень консервативной и примерно одинаковой у всех переносимых белков, но ожидания эти не оправдались. Эти сигнальные участки не отличаются постоянством ни в отношении длины, ни в отношении аминокислотной последовательности, а многочисленные опыты по мутагенезу показали, что они могут претерпевать значительные структурные изменения. Данные о том, что сигнальные пептиды содержат всю информацию, необходимую для транспорта белков через мембраны эндоплазматического ретикулума или внутрь их, были получены в опытах с химерными полипептидами. Присоединение N-концевой сигнальной последовательности к обычным цитоплазматическим белкам, например к глобину, приводило к тому, что они транспортировались в полость эндоплазматического ретикулума [1345].

С точки зрения «сравнительной анатомии» N-концевых сигнальных последовательностей можно выделить три разных в структурном отношении участка: 1) положительно заряженный N-концевой участок (п-участок); 2) центральное гидрофобное ядро из 7—15 остатков (h-участок); 3) С-концевой участок (с-участок), который является полярным и содержит сайт, узнаваемый сигнальной пепти-дазой, которая находится на стороне эндоплазматического ретикулума, обращенной в полость [1528]. Показано, что многочисленные случайные последовательности способны выполнять функцию нормального сигнального пептида у инвертазы дрожжей и детерминировать ее секрецию [720]. Анализ этих случайных последовательностей показал, что решающим фактором является их гидрофобность. На рис. 10.10 приведены данные о гидрофобности и длине гидрофобных участков известных сигнальных пептидов эукариот и большинства гидрофобных участков, обнаруженных в цитозольных белках эукариот (многие из которых расположены на N-конце), а также известных трансмембранных якорных участков мембранных белков. Из этих данных видно, что п-область обладает свойствами, промежуточными между свойствами соответствующих участков цитозольных белков, с одной стороны, и типичных трансмембранных сегментов — с другой.

Очевидно, структурная специфичность для процесса узнавания не играет существенной роли. Однако необходимо помнить, что изменение свободной энергии менее чем на 5 ккал/моль (примерно такова энергия одной водородной связи) соответствует изменению сродства в 1000 раз. Такое различие в сродстве вполне может быть обусловлено тонкими различиями между функциональными и нефункциональными сигнальными последовательностями. Моделью рецептора сигнального пептида может служить растворимый фрагмент антигена гистосовместимости класса I, а именно HLA-A2, трехмерная структура которого известна [104]. Этот белок связывается с пептидами — компонентами чужеродных антигенов, что является

Биогенез мембран 477

25 г

20 - о о

0 5 Ю 15 20 25 30

Длина(число остатков)

Рис. 10.10. Зависимость суммарной гидрофобности от длины полипептида [1528]. Темные кружки — сигнальные пептиды эукариот; светлые кружки — С-концевые транс-мембраиные заякоривающие сегменты; треугольники — наиболее гидрофобные участки ряда цитозольиых белков. Данные, ограниченные двумя прямыми, охватывают 92% сигнальных пептидов, 20% якорных участков и 4Щ последовательностей цитозольных белков.

частью иммунного ответа (разд. 9.3.4). Область связывания пептида представляет собой большой желобок, открытый с одного конца и способный вмещать пептид из 20 аминокислотных остатков, если тот имеет форму а-спирали. О пептидах, которые могут связываться с HLA-A2, известно немного; показано, в частности, что близкородственный антиген гистосовместимости класса II проявляет высокое сродство к самым разным аминокислотным последовательностям. По-видимому, наиболее важными ббщими характеристиками пептидов, которые могут связываться с высоким сродством, являются вторичная структура и амфифильность. Стабилизации комплекса могут способствовать многочисленные взаимодействия в области связывания.

Известно, что относительно небольшие различия между сигнальными последовательностями порождают огромные различия в поведении белка. Например, если сигнальная последовательность не распознается сигнальной пептидазой, то белок чаще остается связанным с мембраной, чем секретируется (рис. 10.3, Б) [861], хотя есть и исключения из этого правила [1345, 608]. Обычно сигнальные последовательности, которые служат также N-концевыми якорями,

478 Глава 10

{а} Сенрстируомый белок

Пре про пара тцреоидный гормон

¦ - J

MMSAKDMVKVMIVMLAICFLARSDG

-20 -10 -1

(61 N-концевой якорь/сигнал (n-конец S цитоплазме) Трансферриновыи рецептор человека

(57 остатков)- ¦ KPKRCs|gs|CYGTIAVIVFFUGFM||gyLG

(в)Н-кенигвой янорь/сигнал (ч-нонец вне цитоплазмы) Реакционный центр н-субьединицы н. viridis

imyhgalaqhidJiaqlvwyaqwlviwtvvlly Jlrredrr

(г) Периплазматичесний белок E.coli р-Локтамаза

I

msiqhfrvalipffaafclpvfa

-20 -Ю -1

(д) белок наружной мембраны E.coli OmpA

mkktaiaiavalagfatvaqa

-20 - 10 -1

Рис. 10.11. Некоторые N-концевые сигнальные последовательности, ответственные за транспорт белков в эндоплазматнческий ретикулум эукариот или через него (о и б) либо в цитоплазматическую мембрану грамотрицательной бактерии. Сигнальные последовательности в случаях бив являются также стоп-сигналами переноса и мембранными якорями, но оии имеют противоположную ориентацию в бислое.

имеют более протяженный гидрофобный h-участок длиной около 20 аминокислотных остатков; этот участок необходим для остановки переноса и/или образования стабильного якоря в мембранном бислое [1528]. Примером такой сигнальной/якорной последовательности служит трансферриновыи рецептор (рис. 10.11). Заметим, что в этом случае сигнальная последовательность расположена не иа N-конце, а на расстоянии более чем 50 аминокислотных остатков от него.

Известны также случаи, когда сигнальная последовательность закрепляет зрелый белок в противоположной ориентации, т. е. N-конец оказывается обращенным наружу [1528]. В качестве примера можно привести цитохром Р450 микросом крысы ([108] и рис. 3.11),

Наружная мембрана Внутренняя мембрана

Биогенез мембран 479

инвариантную церь антигенов гистосовместимости класса II мыши [862], несколько вирусных белков [1589] и Н-субъединицу реакционного центра R. viridis (рис. 3.6). Каким-то образом эти сигналь-ные/якориые последовательности «проталкивают» свой N-коиец через мембрану и останавливают трансляцию, так что основная часть белка остается в цитоплазме (рис. 10.3, д). Отмечалось [1528], что в некоторых из этих случаев сигнальные последовательности «старт/стоп» несут по крайней мере один отрицательный заряд в п-области (см., например, рис. 10.11). Однако для встраивания указанных мембранных белков, как и белков обычного типа, используется одинаковый аппарат переноса — СРЧ [1274,862]. Возможно, наличие отрицательного заряда облегчает самопроизвольный или опосредованный белком перенос N-концевых остатков через мембрану.

Как мы уже отмечали, сигнальные последовательности не обязательно находятся на N-конце белковой молекулы и могут направлять перенос обоих фланкирующих доменов, по крайней мере в случае искусственных гибридных белков [1345, 1137]. Уникальным примером такого рода является овальбумин, секреция которого детерминируется неотщепляемой внутренней сигнальной последовательностью [423]. У многих мембранных белков эндоплазматического ретикулума неотщепляем ые сигнальные последовательности тоже расположены в средней части полипептидиой цепи и играют роль трансмембраниых якорей (рис. 10.3, з). В качестве примера можно привести асиалогликопротеиновый рецептор [641, 1372]. Внутренняя сигнальная последовательность этого белка использует тот же аппарат переноса, что и N-концевая последовательность; и действительно, в искусственных гибридах эта внутренняя сигнальная последовательность функционирует как обычная N-концевая последовательность [1372]. Примерами белков с внутренней неотщепляемой сигнальной последовательностью, которые имеют многочисленные трансмембраниые сегменты и N-конец которых находится на внутренней стороне мембраны, служат переносчик глюкозы и анионный переносчик белок полосы 3 [1268, 1576, 1028] (рис. 10.3, ж). Напротив, у опсина, тоже содержащего внутренний неотщепляемый сигнальный пептид, N-конец находится с наружной стороны мембраны [51] (рис. 10.3, е). Этот внутренний сигнал (предположительно первый трансмембранный сегмент) протягивает гидрофильный аминокислотный домен (36 аминокислотных остатков) через мембрану, и, таким образом, его ориентация противоположна той, которая наблюдается в более общем случае при переносе полипептида, начиная с С-конца. Причина такого поведения опсина неизвестна; возможно, важную роль играет природа N-концевого пептида [51].

Итак, от небольших изменений в сигнальных последовательностях зависит, будет ли «белок-пассажир» секретироваться в полость

480 Глава 10

эндоплазматического ретикулума или ои останется прикрепленным к мембране, н какой будет ориентация N-конца мембранного белка. Было показано, что существуют все возможные топологические варианты (рис. 10.3). Важным моментом является то, что во всех случаях сборка осуществляется при помощи одного и того же аппарата.

Стоп-сигналы переноса

Как отмечалось в предыдущем разделе, для неотщепляемых сигнальных последовательностей, которые играют роль N-концевых якорей в образовавшемся мембранном белке, характерно наличие относительно длинных гидрофобных участков [1528]. Отсюда следует, что перенос может останавливаться просто при наличии протяженного гидрофобного участка, который способен образовать трансмембранную а-спираль. В пользу такого предположения свидетельствуют некоторые экспериментальные данные. Например, с помощью рекомбинантной ДНК в среднюю часть белка Е. coli, в норме секретирующегося через плазматическую мембрану, встраивали гидрофобные сегменты [295]. Если их длина была не менее 16 аминокислотных остатков, то транспорт белка блокировался и он оставался присоединенным к плазматической мембране. Можно возразить, что в данном случае речь идет о бактериальной системе, но, как мы увидим ниже (см. раздел, посвященный сигнальным последовательностям бактерий), механизмы переноса в про- и эукариотических системах, по-видимому, сходны. Далее были сконструированы варианты G-белка вируса везикулярного стоматита с измененными мембранными доменами. Длина гидрофобного сегмента могла составлять ие 20, а 8 остатков, при этом полипептид оставался трансмембранным, хотя транспорт в плазматическую мембрану блокировался [2]. Таким образом, природа стоп-сигнала переноса точно не известна. Необходимо выяснить два вопроса: 1) участвуют ли в остановке процесса специфические белки аппарата переноса; 2) определяется ли остановка переноса гидрофобиостью стоп-сигнала или какими-то более тонкими факторами? Было показано, что участки стоп-сигнальиой последовательности, ответственные за блокирование переноса через эндоплазматический ретикулум, могут никак не влиять на транспорт через мембрану хлоропласта [878]. Это означает, что упомянутые два процесса могут существенно различаться.

Определение старт- и стоп-сигналов подразумевает линейную схему переноса, начинающегося с N-конца; об этом свидетельствует поведение простых систем. Однако оказалось, что последовательности, которые блокируют перенос в одном случае, могут инициировать его в другом [51, 1000]. Следовательно, важна не только

Биогенез мембран 481

природа самих стоп- или старт-последовательностей, но и их окружение в полипептиде.

Вторичные сигналы экэоцитозной системы

Функция сигнального пептида состоит в направлении белков в эндоплазматический ретикулум и в инициации переноса. Из рис. 10.1 видно, что как мембранные белки, так и растворимые белки, которые попадают в полость эндоплазматического ретикулума, имеют несколько мест назначения. Информация, определяющая их локализацию, каким-то образом кодируется в зрелом полипептиде. В отсутствие вторичного сигнала водорастворимые белки секретируются с помощью «конститутивной» секретирующей системы [1249]. Достигнуты определенные успехи в идентификации сигналов, ответственных за направление растворимых белков в лизосомы или секреторные гранулы либо за удержание их в эидоплазматическом ретикулуме или пузырьках Гольджи (табл. 10.1). Возможно, участки этих полипептидов взаимодействуют с мембранными рецепторами, вызывая замедление их экспорта [1249].

О сигналах, ответственных за локализацию интегральных мембранных белков в экэоцитозной системе, известно немного. По-видимому, за фиксацию белка Е19 аденовируса в мембране эндоплазматического ретикулума отвечает короткая последовательность на С-конце молекулы [1115]. Этот белок имеет единственный трансмембранный сегмент и цитоплазматический «хвост» из 15 остатков на С-конце. Уменьшение длины «хвоста» только на восемь аминокислотных остатков приводит к транспорту белка из эндоплазматического ретикулума. Возможно, сигнальный участок взаимодействует прямым или косвенным образом с некой цитоплазматической структурой, что обеспечивает заякоривание белка Е19 в эидоплазматическом ретикулуме. Исследования гликопротеина Е1 коронави-руса показали, что сигнальная последовательность, ответственная за его нахождение в аппарате Гольджи, локализована в одной из трех предполагаемых трансмембранных спиралей [899].

Сходная проблема сортировки возникает при выявлении вторичных сигналов, ответственных за направление мембранных белков в нужный домен плазматической мембраны в поляризованных эпителиальных клетках [937]. В этой работе использовались в основном вирусы с оболочкой, которые отпочковываются либо

страница 68
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.04.2017)