Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

о олигосахарида (рис. 10.4 и 10.5), что очень помогло определению различных компонентов комплекса Гольджи (цис-, медиальных и /пренс-цистерн). Олигосахаридный предшественник с высоким содержанием маннозы (рис. 3.16) присоединяется по местам гликозилирования в полипептиде (по остаткам аспарагина), когда белок находится внутри эндоплазматического ретикулума, а затем с помощью нескольких расположенных в различных компарт-ментах ферментов осуществляется процесс созревания [552, 358, 1153, 634, 1245]. Это позволяет следить за превращением белков, определяя состояние их гликозирования. На рис. 10.5 представлен

462 Глава 10

dJeDoio6amb:u эчдоплаз -vamwecHuu реп.икулум

*•«»«••»*• ^-1

Па л ость

мсмЬрана

ж- * Медиальная ^. иистерна

I прайс-цистерна

I Цитохимических \ I корнер

Окисленный тспроксиЬ осмия

HADP а за

Тиаминпирофосфат а за

\\гнранс-семь >) Гапьдж:! Кислая фосфа паза.

Зндссома

Конститу- Негулируе- *• тидныи путь мый путь Лизосома

Функции /Ферменты — диохимические марнерь

Фос форилирова ние лизосомнь,! Фермента8{ 7) Маннозидаза I

Присоединение GlcNAc (N - Ацетилглюкозамин-трансфераза I) Отщепление маннозн к Маннозидаза и )

,".''.' соеди не ние глюкозы (Га / антози л траисфераза)

Прцюединение сиаловой нислотьг

^Сиалилтрансфераза '

Плазма ти чес на я мемЬоа на

Рис. 10.4. Схема экзоцитоза мембранного белка (стрелки) от момента его попаданий в эндоплазматический ретнкулум до включения в плазматическую мембрану [552]. Различие между транс-цистернами Гольджи и тронс-сетью Гольджи чисто гипотетическое [11]. Предполагается, что транспорт осуществляется при помощи везикул. GlcNAc — ^ацетилглюкозамин.

процессинг олигосахаридного предшественника с высоким содержанием маннозы.

В исследованиях экзоцитозного пути был достигнут значительный прогресс благодаря использованию вирусов с оболочкой, в частности вируса везикулярного стоматита (VSV). Механизм проникновения генома таких вирусов в клетку путем слияния мембраны вирусной частицы с мембраной животной клетки обсуждался в разд. 9.5.2, а процесс отпочковывания вирусных частиц от мембраны животной клетки — в разд. 4.5.3. Гликопротеин шиловидной структуры вируса везикулярного стоматита, называемый G-бел-ком, — это трансмембраниый белок, который синтезируется на рибосомах, связанных с эндоплазматическим ретикулумом, после инфекции. С помощью экзоцитозного пути G-белок попадает на плазматическую мембрану, где он участвует в образовании отпочковывающегося вируса (рис. 4.9). Инфицируя клетки этим вирусом, можно проследить за процессингом кодируемого вирусным геномом G-белка, что позволит исследовать экзоцитозный путь [1250, 61, 1099, 168, 60]. Этот подход используется для идентификации везикул, участвующих во внутриклеточном транспорте [1099], для изу-

Биогенез мембран 463

GlcNAc

м.

SA Gal

SA Gal

GlcNAc GlcNAc M M

Gal Gal

GlcNAc GlcNAc I

— U M —

M

I

GlcNAc GlcNAc

1

— M m

Рис. 10.5. Процессинг олигосахарного предшественника с высоким содержанием маннозы, осуществляющийся в комплексе Гольджи [358]. В эндоплазматическом ретику-луме отщепляются три остатка глюкозы и по крайней мере один остаток маннозы с образованием предшественника, изображенного вверху слева. На стадиях А и Б происходит фосфорилирование одного остатка маннозы при участии лизосомных ферментов. На стадиях 1—6 образуется разветвленный (с двумя ветвями) олигосахарид. в зтом процессе участвуют следующие ферменты: маннозидаза I комплекса Гольджи (1), GlcNAc-траисфераза (2), маннозидаза II (3), GlcNAc-траисфераза II (4), галакто-зил,трансфераза (5) и сиалилтрансфераза (6). М — манноза, GlcNAc — N-ацетилглюко-замин, Gal — галактоза, SA — сиаловая кислота, Р — фосфат, R — (GlcNAc)2-acna-рагин-(белок).

чения влияния гликозирования на доставку белков к клеточной поверхности [168], для исследования энергетики экзоцитозного транспорта и, что наиболее важно, для создания бесклеточной системы везикулярного внутриклеточного транспорта [1250, 61].

Эти исследования выявили несколько замечательных особенностей системы экзоцитозного транспорта.

1. Транспорт между различными компартментами органеллы осуществляется с помощью везикул, которые отпочковываются от «донорной» мембраны и потом сливаются с «акцепторной». Показано, что везикулы, участвующие в транспорте между компартментами комплекса Гольджи, являются «окаймленными», но соответствующий белок отличается от клатрина, окаймляющего эндоци-тозные везикулы [1099]. Имеются веские данные в пользу того, что клатрин не является существенным компонентом экзоцитозного пути [344, 1254], хотя он, по-видимому, необходим для нормального роста некоторых штаммов дрожжей [832]. Степень общности ком-

поиентов эидоцитозного и экзоцитозного путей неясна, хотя некоторые везикулы, вероятно, функционируют в обоих случаях [433].

2. Для внутриклеточного транспорта необходим АТР [1250, 61, 60], а также белковые компоненты цитозоля [1558]. Показано, что для транспорта между цистернами Гольджи, осуществляющегося при участии везикул, необходимо жирнокислотное производное ацил-СоА [520. 1250]. Какую именно функцию выполняют указанные соединения в отпочковывании и слиянии везикул, неизвестно.

3. Роль олигосахарида как сигнала сортировки новосинтезиро-ванных гликопротеинов, по-видимому, непостоянна. Известны случаи, когда процессинг N-концевого углевода не является необходимым для экспрессии белка плазматической мембраны на клеточной поверхности [285, 168]. В других системах гликозилирование существенно для доставки белка к клеточной поверхности [557], например, оно необходимо для включения опсина в мембрану наружного сегмента палочки сетчатки [440]. Во многих клетках млекопитающих сигналом сортировки для белков, направляемых в лизосомы, является маннозо-6-фосфат [778], однако для дрожжей это не характерно [1485, 711]. В тех клетках млекопитающих, где маннозо-фосфат функционирует как сигнал сортировки, обнаружены два мембранных рецептора с высоким сродством к гликопротеинам, содержащим маннозо-6-фосфат, и клонированы их гены [1385, 869, 1168]. Они играют ключевую роль в процессе переноса конкретных полипептидов в лизосомы, а один из этих рецепторов существен как для эндоцитоза, так и для экзоцитоза [1385, 139].

"Донорная" фракция, содержащая комплекс Гольджи из мутанта 15винфицированного вирусом визикулярного стоматита

"Акцепторная ''фракция, содержащая комплекс Гольджи из неинфицирован-нь/z клеток дикого типа

СООН

соон

'ЧЗ -вело к Донорньш (вируса вези-компартмент [нулярного его-\оматига

соон

[о - Манноза ;d-GIcNAc-,«-[4h] GlcNAc)

Рис. 10.6. Метод, используемый для контроля транспорта белка между компартмен-тами комплекса Гольджи in vitro [61]. Для присоединения [3H]GlcNAc к олигосахариду центральной части необходимо перенести вирусный G-белок из комплекс Гольджи инфицированных клеток в комплекс Гольджи, полученный из клеток с активной N-аце-тилглюкозаминтрансферазой 1. GlcNAc — N-ацетилглюкозамин.

Биогенез мембран 465

Исследование бесклеточной системы, изображенной на рис. 10.6, показало, что для изучения таких сложных систем полезно использовать специфические мутанты. Выделено множество мутантных штаммов дрожжей, дефектных по разным стадиям экзоцитозного пути [326, 421], и некоторые из них использовались при создании бесклеточной системы транспорта между органеллами [599]. Оказалось, что системы дрожжей и млекопитающих весьма сходны [359], и для исследования последних можно с успехом использовать му-тантные штаммы дрожжей. Наконец, обнаружено, что многие вирусы с оболочкой способны отпочковываться не только от плазматических, но и от других мембран и, таким образом, могут быть полезны для изучения других аспектов внутриклеточной сортировки белков и мембранного транспорта [1240].

Дополнение 10.1. Изучение внутриклеточного

транспорта, осуществляемого с помощью везикул in vitro

На рис. 10.6 схематически представлен метод изучения транспорта вирусного G-белка между соседними компартментами комплекса Гольджи in vitro. Важной особенностью метода является то, что он позволяет определить биохимическим путем компоненты, необходимые для этого процесса. Из двух типов клеток, обозначаемых как «донор» и «акцептор», выделяют мембранные фракции, содержащие комплекс Гольджи. При этом донорную фракцию получают из мутантных клеток, у которых отсутствует фермент UDP-N-ацетилглюкозамингликозилтрансфераза I и которые были инфицированы вирусом везикулярного стоматита. Процессинг олигосахарида, связанного с G-белком, в этих клетках блокирован. Акцепторную фракцию получают из неинфицированных клеток дикого типа. Для присоединения [3Н]Ы-ацетилглюкозамина к новосинтезирован-ному G-белку должен произойти перенос G-белка от донорной фракции к акцепторной, где необходимый фермент имеется. Количество включенного [3Н]гЧ-ацетилглюкозамина определяют после иммунопреципитации. Данная методика позволяет исследовать транспорт из j/ис-компартмента аппарата Гольджи в медиальный компартмент [61]. Аналогичные работы, в которых наблюдали за присоединением сиаловой кислоты, выявили наличие транспорта in vitro между транс-элементами аппарата Гольджи [1250].

466 Глава 10

10.3. Характерные особенности биосинтеза мембранных белков [1268, 1576, 1195]

Проблема сборки белков очень важна. Как мы увидим, этот процесс обычно не протекает самопроизвольно, лишь в результате взаимодействия между образующимися полипептидами и липидным бислоем. Напротив, он является энергозависимым и опосредуется белковыми структурами, которые пока не изучены в достаточной степени. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что перенос белков через мембрану (например, в полость эндоплаз-матического ретикулума) и сборка интегральных мембранных белков — это тесно связанные стороны одного и того же процесса. Логично ожидать, что проблемы транспортировки белков через мембраны и их укладки должны решаться одинаковым образом. Прежде чем обсуждать общие особенности сборки молекул в различных системах, полезно остановиться на методах экспериментального исследования этого процесса.

Наиболее детально изучены бесклеточные системы, в которых гораздо легче количественно исследовать процессы переноса и про-теолитического процессинга белков. Во всех этих системах используются мембранные везикулы или препараты органелл, у которых поверхность, обращенная в цитоплазму, «смотрит» наружу, поскольку перенос белков осуществляется из цитоплазмы. Этому условию удовлетворяют микросомы, полученные из эндоплазмати-ческого ретикулума секретирующих клеток, митохондрий и хлоропластов. Вывернутые везикулы можно получить из клеток Е. coli; они представляют собой удобный объект для изучения переноса белков в бесклеточной системе [1034, 204, 500].

Полипептид-предшественник, находящийся во внешней среде, при соответствующих условиях будет переноситься внутрь пузырька или по крайней мере через мембрану пузырька или органеллы. За этим процессом обычно следят, добавляя протеазы во внешнюю среду. Степень защиты от протеолиза является мерой количества полипептида, транспортированного внутрь везикулы или органеллы. Как показано схематически на рис. 10.7, за ходом протеолити-ческого процессинга, осуществляемого сигнальной пептидазой, следят с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Белки, встроившиеся в мембрану, можно идентифицировать с помощью щелочной экстракции; при этом предполагается, что белки, которые связаны с поверхностью мембран, при такой обработке удаляются. Однако так бывает не всегда, поэтому результаты, полученные с помощью щелочной экстракции, необходимо интерпретировать с осторожностью.

В таких бесклеточных системах можно изучать биохимические условия переноса белков и идентифицировать необходимые раство-

Биогенез мембран 467

Ридосама

\___J Поглощения не проис

(з) Полный перенос секрета -руемого белна

Предшественник Зрелая форма -

Перед про 1 добабле теазы 2 нием 3 После про 1 Ыабле теаэы 2 ¦1ия 3

Рис. 10.7. Схема проведения опыта по изучению встраивания белка в мембрану везикулы. Метод основан на защите полнпептида от протеолнтического расщепления при проникновении его (частично нли полностью) в везикулу. Белки (обычно радиоактивно меченные) подвергают нммунопреципитации и анализируют с помощью электрофореза в ПААГ—ДСН. Сигнальный пептид этим методом не обнаруживается.

римые компоненты. Кроме того, при этом можно варьировать природу переносимого полипептидного «субстрата». Аналогичные исследования можно проводить in vivo с помощью метода импульсного мечения. При этом уменьшается вероятность появления артефактов, связанных с искусственностью бесклеточных систем [1345, 1497, 275].

При изучении бесклеточных систем были получены весьма важные данные об условиях, необходимых для переноса белков.

1. Посттрансляционный и котрансляционный перенос. Принято считать, что во всех исследованных системах перенос в мембраны или через мембраны может осуществляться независимо от трансляции [1288]. Убедительные данные на этот счет были получены для процесса переноса белков в хлоропластах и митохондриях, а также — после длительных дискуссий — для переноса через бак-

468 Глава 10

термальную мембрану. Долгое время считалось, что перенос белков в эндоплазматический ретикулум или через мембраны эндоплазматического ретикулума всегда осуществляется параллельно трансляции, однако в конце концов было четко показано, что такая параллельность не обязательна. По крайней мере в одном случае — для препро-а-фактора — наблюдался посттрансляционный транспорт в микросомы дрожжей, не зависящий от рибосом [1555, 589]. Было также показано, что хотя у высших эукариот для переноса через эндоплазматический ретикулум элонгации белков не требуется [1136, 1029, 1028], в большинстве случаев процесс переноса все же зависит от рибосом и происходит в то время, когда новосинтезиро-ванный полипептид еще удерживается рибосомой [1136], Важный вывод состоит в том, что энергия, необходимая для переноса, не исходит от рибосомного биосинтетического аппарата.

Заметим, что эти данные лишь констатируют то, что процессы переноса и трансляции можно разграничить экспериментально. В клетке эти процессы тесно связаны по крайней мере в случае белков, транспортируемых в эндоплазматический ретикулум клеток млекопитающих, и многих белков Е. coli [83].

2. Энергетические требования к переносу. Как правило, перенос белков в мембраны или через них энергозависим. Необходимым условием переноса как для прокариотических, так и для эукариотических систем является гидролиз АТР (или другого нуклеозидтрифос-фата). Это было показано для следующих процессов: а) переноса белков в строму хлоропластов [1117, 442]; б) транспорта белков в митохондриальный матрикс [371, 1149, 207], внутреннюю [1149] и наружную мембраны [76]; в) переноса белков через эндоплазматический ретикулум дрожжей [589, 1555] и пост-трансляционного встраивания мембранного белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих [10288]; г) переноса белков через цитоплазматиче

страница 66
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(28.06.2017)