Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

мые процессы. Такие слабые основания часто называют «лизосомотропны-ми» или «ацидотропными» агентами. Моненсин уравновешивает протонный и К+-градиенты (разд. 7.5.2), что также увеличивает рН в вакуолях.

Добавление этих агентов часто предотвращает рециклирование рецепторов клеточной поверхности. Комплексы рецептор—лиганд при этом не диссоциируют, и рецепторы накапливаются во внутренних мембранных везикулах, не достигая клеточной поверхности. Такая картина наблюдается, например, для ЛНП- и асиалоглико-протеинового рецепторов. По-видимому, обмен между периферическими эндосомами и плазматической мембраной при этом не ослабевает [1287, 863], однако миграция к лизосомам может блокироваться [863].

420 Глава 9

Большие успехи в изучении этой сложной системы сортировки были достигнуты благодаря применению электронной микроскопии при искусном использовании таких клеток, как пероксидаза хрена, а также (сравнительно недавно) рН-контролирующих меток [1100]. Весьма полезными оказались и генетические подходы, основанные на резистентности к определенным токсинам и вирусам при неполном закислении эндоцитозных везикул [956]. Источником соответствующих мутантов могут быть дрожжи [1218]. Биохимические исследования основываются на выделении и характеристике хорошо известных субпопуляций эндоцитозных везикул. Для разделения эндоцитозных и экзоцитозных везикул используются специально разработанные электрофоретические методы [834, 927], подходы, основанные на иммунологическом сродстве [555], а также процедуры со смещением плотности при использовании холинэстеразы [617, 834]. В некоторых лабораториях удалось провести слияние изолированных эндоцитозных пузырьков in vitro и показать, что для этого необходим АТР; слияние происходило только в случае эндоцитозных пузырьков, полученных в течение 5—15 мин после интерналнзации [555, 285, 130].

9.4.3. КЛАТРИН [1130]

При эндоцитозе наблюдаются в первую очередь такие структуры, как окаймленные ямки и окаймленные везикулы. Их характерной особенностью является наличие на цитоплазматической поверхности полигональной решетки, образуемой клатрином. Свойства клатрина и ассоциированных с ним белков определяют, какие именно рецепторы скапливаются в окаймленных ямках; эти свойства каким-то образом опосредуют и изменение мембраны, приводящее к отшнуровыванию окаймленных везикул. Молекула клатрина содержит три тяжелые цепи (180 кДа) и три легкие (30 — 40 кДа) и имеет сложную структуру с тремя ветвями; каждая из ветвей образована одной тяжелой цепью и одной легкой. Выделенный клатрин спонтанно ассоциирует с образованием полигональной решетки как в присутствии, так и в отсутствие мембран. Работы по реконструкции с очищенными плазматическими мембранами показали, что в местах образования окаймленных ямок имеется ограниченное число участков связывания с высоким сродством к клатрину [1014]. С клатриновой решеткой связаны и вспомогательные белки с мол. массами 100 и 50 кДа.

Каждая клетка продуцирует два основных класса легких цепей клатрина. Они кодируются двумя разными генами, мРНК которых подвергается дифференциальному сплайсингу, что приводит к появлению по меньшей мере четырех разновидностей белков [685, 758]. Тяжелые цепи играют структурную роль, а легкие, вероятно,

Клеточная поверхность 421

выполняют регуляторную функцию и содержат места связывания кальмодулина, а также АТР-зависимого раздевающего белка [1253]. В клетке половина клатрина находится в растворе, и между этой формой и мембранными структурами поддерживается динамическое равновесие. До слияния окаймленных везикул с эндоцитозной системой из них должен высвободиться клатрин; эта реакция катализируется раздевающим белком, который выполняет чисто каталитическую функцию, однако остается прочно связанным с молекулами клатрина даже в отсутствие клатриновой решетки. В клетке этот белок находится в избытке по отношению к клатрину.

Чтобы понять природу рецепторзависимого эндоцитоза и его регуляции, необходимо выяснить механизм перехода клатрина из мономерной формы в мембраносвязанную структуру и обратно, а также механизм образования таких структур на мембране.

9.4.4. НЕКОТОРЫЕ ПРИМЕРЫ ИНТЕРНАЛИЗУЕМЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Рассмотрим вкратце свойства некоторых рецепторов. Все они имеют единственный трансмембранный домен, но этим сходство и ограничивается. Мы остановимся на рецепторах групп I, III и IV. Рецепторы пептидных гормонов, относящиеся к группе II, описаны в разд 9.7.

ЛНП-рецептор человека [152, 1404]

Это типичный рецептор группы I, который возвращается к плазматической мембране, в то время как его лнганд, сыворотчный липопротеин низкой плотности (ЛНП), попадает в лнзосому. Особенно богаты этим рецептором клетки печени и надпочечников, куда ЛНП поставляют холестерол для синтеза желчных кислот и стероидных гормонов соответственно. По данным об аминокислотной последовательности рецептора, определенной с помощью кДНК, он состоит из пяти доменов (рис. 9.8). Выраженная гомология с другими мембранными рецепторами отсутствует, хотя два самых крупных наружных домена содержат повторы, богатые цистеином н гомологичные соответственно фактору С9 комплемента и предшественнику ФРЭ. Рецептор имеет единственный трансмембранный домен и непротяженный цитоплазматический С-концевой домен. Показано, что у лиц с таким генетическим заболеванием, как семейная гиперхолестеролемия, ЛНП-рецепторы не функционируют. Установить функции структурных доменов рецепторов помог мутационный анализ. Так, было показано, что модификации в цитоплазма-тическом домене ЛНП-рецептора препятствуют связыванию рецептора с окаймленными ямками, даже если связывание ЛНП с рецептором не изменяется [833, 289]. Помимо выявления мутаций, про-

422 Глава 9

1. Домен, св>-„ зы бающий лиганд, 292 аминокислотных остатка

2.Домен,гомологичный предшест -веннину ФРЗ, ~ 400 амино-мислотнь/х остатков

3. Домен^содержащий 0-связанные сахара ; 58 аминокислотных остатков

4 мемЬрахныи сегмент; ^аминокислотных ' остатка

5. Цитоплазматический доменаминокислот -ных астат-

Л О)

Рис. 9.8. Схематическое представление пяти структурно различающихся доменов ЛНП-рецептора человека [152].

исходящих in vivo, проводились опыты in vitro для получения необходимых мутаций и определения свойств экспрессированного продукта гена. Для этого применялась рекомбинантная ДНК, в которой отсутствовал ген, который кодирует домен, гомологичный предшественнику ФРЭ (домен 2). Такой рецептор связывает ЛНП, но не высвобождает его при закислении [288]. Это блокирует рециклирование рецептора и ведет к его деградации после связывания лиганда.

Асиалогликопротеиновый рецептор

Этот рецептор группы I, называемый также печеночным пектином, связывается с десиалированными гликопротеинами сыворотки и узнает гликопротеины с галактозой или N-ацетилгалактозой на конце. Следует отметить две интересные особенности: 1) рецептор

Клеточная поверхность 423

имеет единственный трансмембранный сегмент и является одним из нескольких рецепторов, у которых N-конец обращен в цитоплазму [1371, 844] (см. рис. 10.3); 2) в растворе детергента этот рецептор находится в виде гексамера [870], причем множество таких гек-самеров встречается и в мембране. Асиалогликопротеиновый рецептор гомологичен рецептору с низким сродством к IgE, который находится на лимфоцитах человека [747] и функция которого неизвестна.

Рецептор для полимерного (1дА/1дМ) иммуноглобулина [1024, 1023]

Этот рецептор (группа 111) связывает иммуноглобулины IgA или IgM из сыворотки и транспортирует их от базолатеральной мембраны к апикальной поверхности гепатоцитов (рис. 9.7). Во время этого процесса рецептор расщепляется и часть его, связанная с молекулой lg, высвобождается в желчь гепатоцитов. Таким образом, рецептор используется только один раз и не восстанавливается. Как видно из рис. 9.3, данный рецептор относится к суперсемейству иммуноглобулинов и имеет пять внеклеточных иммуноглобулинопо-добных доменов. Показано, что его цитоплазматический домен существен для эндоцитоза [1023].

Трансферриновый рецептор

Этот рецептор (группа IV) участвует в поглощении железа из сыворотки. Рецептор связывается с трансферрином, содержащим два атома железа, интернализуется и остается связанным с апо-трансферрином после отсоединения атомов железа в кислых эндоцитозных везикулах. Как и в случае ЛНП-рецептора, концентрирование этого рецептора в окаймленных ямках и его интернализация продолжаются и в отсутствие лиганда. Рецептор представляет собой димер с дисульфидными связями, гликозилированный и ацили-рованный по меньшей мере по одному остатку цистеина, который был идентифицирован с помощью сайт-специфического мутагенеза [710]. Одна субъединица состоит из 760 остатков, н ее N-конец обращен в цитоплазму. Для интернализации трансферринового рецептора, как и рецепторов ЛНП, IgA (IgM) и ФРЭ, необходимо наличие цитоплазматического домена [1247]. Этот домен содержит несколько сериновых остатков, которые могут быть фосфорилирова-ны„ но, как было показано, эти остатки несущественны для интернализации [1247]. Тем не менее было установлено, что форболовые эфиры, активирующие протеинкиназу С (разд. 9.7.2), уменьшают число трансферриновых рецепторов на поверхности клетки и попутно вызывают их фосфорилирование [943, 673]. Напротив, инсулин

424 Глава 9

Клеточная поверхность 425

и другие митогены способствуют концентрированию рецептора на клеточной поверхности, по-видимому, путем увеличения скорости его экстернализации [1550, 1437]. Механизм этого явления неизвестен, но полагают, что распределение этого и других рецепторов между плазматической мембраной и внутренними везикулами является важным регуляторным фактором.

9.5. Слияние мембран [1594, 881, 1593, 1571]

Анализ процессов перемещения мембранных компонентов, предпринятый в предыдущем разделе, показывает, что слияние отдельных мембранных структур внутри клетки является весьма распространенным и очень существенным клеточным процессом. Такое слияние должно происходить очень быстро и с высокой избирательностью, без утечки вакуолярного содержимого в цитоплазму. Регуляция процесса должна быть очень тонкой. Например, плазматическая мембрана быстро сливается с периферическими эндоци-тозными пузырьками, но не с плазматическими мембранами соседних клеток; с ними она слипается. Каков механизм слияния мембран и как он регулируется? Ответы на эти вопросы пока не получены, но из экспериментов на модельных мембранах установлены минимальные требования к слиянию мембран [1594] и показано, что в быстром и избирательном слиянии могут участвовать белки; об этом свидетельствуют результаты работ с использованием белков шиловидных выростов оболочки вирусов животных [1571]. Эти исследования показали, что слияние может происходить по крайней мере в два этапа. Во-первых, сливающиеся мембраны должны вступить в тесный контакт. Для этого необходимо преодолеть электростатическое отталкивание и, что наиболее важно, должна произойти дегидратация полярных групп липидных молекул. Во-вторых, в плотно прилегающих друг к другу бислоях должен существовать некий локальный дефект упаковки, чтобы могли реализоваться межмембранные гидрофобные взаимодействия. На каждом из этих этапов могут принимать участие белки, что, вероятно, и происходит in vivo.

9.5.1. РАБОТЫ С ЛИПИДНЫМИ ВЕЗИКУЛАМИ

Для опытов использовали две модельные системы: слияние липидных везикул и слияние плоской модельной мембраны с липидными везикулами [9]. За процессом слияния можно следить с помощью светового или электронного микроскопа [718], но чаще проводят прямой количественный анализ слияния внутренних компартментов или смешивания липидов, образующих везикулы [1594, 362]

ОтЗельнь е Агрегировавшие Начало Слияние

везииль' везикулы слияния

Рис. 9.9. Слияние фосфолипидных везикул. Липидные фазы и содержимое везикул при простой агрегации везикул не перемешиваются. Инициация слияния представлена как разрастание флуктуационного дефекта в бислое, при этом образование какой-то специальной структуры не подразумевается. Как только происходит слияние, липидные фазы и содержимое везикул перемешиваются. Во многих экспериментах с ф^сфолипид-ными везикулами слияние сопровождается утечкой содержимого.

(рис. 9.9). Пусть одна группа везикул содержит дипиколиновую кислоту, а другая — Tb3 +. При слиянии везикул и смешивании их содержимого эти два реагента быстро образуют сильно флуоресцирующий ТЬ3 + -дипиколинатный комплекс, что и позволяет проводить количественные измерения. За процессом смешивания липидов можно следить, измеряя эффективность переноса энергии электронного возбуждения между флуоресцирующими липидными молекулами, принадлежащими до смешивания разным везикулам [1343]. Эти методы позволяют различать агрегацию везикул и их истинное слияние [362].

Замечательной особенностью однослойных фосфолипидных везикул является то, что самопроизвольно они сливаются с большим трудом. Хотя между противоположными фосфолипидными бислоя-ми существует вандерваальсово взаимодействие, между ними имеется также сильное электростатическое отталкивание, особенно в том случае, когда везикулы содержат отрицательно заряженные фосфолипиды. Например, везикулы, содержащие фосфатидилсерин, не будут агрегировать, поскольку существует значительный энергетический барьер, препятствующий образованию плотного контакта между мембранами, необходимого для образования комплекса. Все фосфолипиды, включая цвиттерионные липиды (такие, как фосфа-тидилхолин), связываются с водой, и для того, чтобы два близлежащих бислоя могли вступить в прямой контакт, этот поляризованный водный слой на поверхности липидного бислоя должен быть удален. Дегидратация фосфолипидов требует больших энергетических затрат, и роль агентов, облегчающих слияние мембран, состоит, в частности, в снижении этого энергетического барьера. Некоторые фосфолипиды (например, фосфатидилэтаноламин) ги-дратированы в меньшей степени, чем другие, и образуют везикулы, которые сливаются гораздо легче. Например, везикулы, состоящие из фосфатидилэтаноламина/фосфатидилсерина, сливаются эффективнее, чем везикулы из фосфатидилхолина/фосфатидилсерина

426 Глава 9

[718]. Векзикулы, состоящие из фосфатидилэтаноламина, слипаются друг с другом сильнее, чем везикулы из фосфатидилхолина, из-за различий в степени гидратации [718].

Дополнение 9.2. Агенты, облегчающие слияние мембран

1. Кальций [718, 845]. При добавлении Са2+ к везикулам, содержащим анионные липиды (такие, как фосфатидилсерин или фосфатидная кислота), часто происходит их слияние. Если везикулы состоят только из анионных липидов, добавление Са2+ приводит к разрушению везикул; если же анионные липиды смешаны с нейтральными (в соотношении 1:1), такими, как фосфатидилэтаноламин, то происходит слияние. Для этого необходимы высокие концентрации Са2+ (-10 мМ), который не может быть заменен Mg2+ . Са2+ нейтрализует отрицательный поверхностный заряд, создаваемый анионными липидами, и облегчает агрегацию везикул. Кроме того, Са2+ особенно эффективен при образовании мостика между анионными фосфолипидами в близлежащих бислоях благодаря форми

страница 60
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.04.2017)