966]. В этом разделе мы рассмотрим эндоцитозный путь, в особенности его связь с функцией рецепторов. В следующей главе будет обсуждаться экзоцнтозный путь с точки зрения мембранного биогенеза

Клеточная поверхность 413

Экзоцитоз Эндоцитоз фагоцитоз

Л

Рис. 9.6. Схематическое изображение мембранного транспорта между внутриклеточными вакуолями и плазматической мембраной [9661. ЭР — эндоплазматический рети-кулум, СГ — секреторная гранула, СВ — секреторная везикула, Л — лизосома, Э1 — периферическая эндосома, Э2 — перннуклеарная эндосома, ОВ — окаймленная везикула, ОЯ — окаймлеииая ямка, РВ — рециклирующаяся везикула, ФЛ — фаголиэосома, Ф — фагосома, Г — аппарат Гольджи. Экзоцнтозный путь обсуждается в гл. 10.

(разд. 10.2). Вопросы слияния мембран и механизмы биологической регуляции этого процесса в общем виде рассматриваются в разд. 9.5.

9.4.1. ОБЩИЕ СВОЙСТВА ЭНДОЦИТОЗНОГО ПУТИ [966]

Разграничим процессы поглощения клеткой крупных чдстиц, растворенных веществ и жидкости. Поглощение крупных частиц называется фагоцитозом и характерно только для клеток некоторых типов (амебы, макрофаги). Процесс активируется частицами и чувствителен к цитохалазину. После образования промежуточной фа-госомы везикула закисляется и затем сливается с лизосомой, содержащей ферменты деградации.

В основе поглощения жидкости (пиноцитоза) и опосредованного рецепторами поглощения растворенных веществ лежит образование окаймленных ямок и окаймленных везикул. Термин «окаймленные» относится к морфологии этих структур, выявляемой с помощью электронной микроскопии. Отличительной их особенностью является наличие решетчатой структуры из молекул белка клатрина, кото-

414' Глава 9

рый связывается с углублениями на поверхности плазматической мембраны (окаймленные ямки) и везикулами, образующимися из таких ямок (разд. 9.4.3). Возможно, существуют и другие эндопи-тозные пути без участия окаймленных везикул, однако о них известно немного [1466]. Окаймленные везикулы участвуют и в экзоцитозе.

На долю окаймленных ямок обычно приходится всего 1 — 2% общей площади поверхности плазматической мембраны, и большинство белков плазматической мембраны не обнаруживаются на этих участках. Однако концентрация некоторых белков в этих ямках очень высока. Например, в них сосредоточено около 70% белка — рецептора липопротеина низкой плотности (ЛНП-рецептор). В некоторых случаях сродство рецептора к окаймленным ямкам постоянно (например, ЛНП-рецептор), в других рецептор концентрируется в них только при связывании лиганда (например, рецептор фактора роста эпидермиса, ФРЭ-рецептор). В табл. 9.2 перечислены некоторые рецепторы плазматической мембраны, участвующие в поглощении специфических лигандов с помощью окаймленных ямок и везикул.

По-видимому, после образования эндоцитозных везикул оболочка из клатрина удаляется специфическим белком в ходе АТР-зависи-

Таблица 9.2. Некоторые рецепторы, интерналиэуемые при эндоцитозе

Группа I. Рецептор возвращается к клеточной поверхности, лиганд поступает в лизосомы

Рецептор маннозы

Рецептор асналогликопротеииа (галактозы)

Рецептор маннозо-6-фосфата . Рецептор си-макроглобулина

Рецептор ЛНП Группа II. Рецептор и лиганд поступают в лизосомы

Рецептор ФРЭ

Инсулнновый рецептор Группа III. Трансцитоз1)

IgA/IgM-рецептор

IgG-рецептор

Группа IV. Рецептор и лиганд возвращаются к одному и тому же домену плазматической мембраны Трансферриновый рецептор

О При трансцитоэе лиганд направляется через клетку от одного домена плазматической мембраны к другому (см. разд. 9.4.2).

Клеточная поверхность 415

мой реакции. Эти данные получены в экспериментах in vitro; роль указанного белка in vivo пока не выявлена. Везикулы без клатрина становятся частью сложной системы трубочек и везикул, называемых периферическими эндосомами; они локализованы вблизи плазматической мембраны. На основе функциональных и морфологических различий [651] субпопуляциям эндосом были присвоены различные названия [такие, как рецептосомы или CURL (compartment of uncupled receptor and ngand)]. Мы будем называть их просто эндосомами. Существует также система эндосом, локализованных вблизи центриолей и комплекса Гольджи; они называются перину-клеарными (околоядерными) эндосомами. Эти структуры почти наверняка также участвуют в эндоцнтозном мембранном транспорте. Конечный пункт эндоцитозного пути находится во вторичных лизосомах, где происходит деградация отдельных растворенных веществ (таких, как липопротенны низкой плотности).

Скорость, с которой происходит рециклирование мембран, поистине удивительна. Ее можно определить с помощью водорастворимых, не проникающих в мембрану меток, оценивая скорость поглощения клеткой внеклеточной жидкости. К таким меткам относятся, например, радиоактивный инулин, декстран, краситель люцифер желтый [1287, 1415]. Измерения, проведенные на гепатоцитах с использованием инулина, показали, что эти клетки поглощают путем эндоцитоза за 1 ч количество жидкости, составляющее ие менее 20% их объема, и количество мембранного материала, по площади превышающее в пять раз площадь их базолатериальной плазматической мембраны [1287]! Скорость эндоцитоза у других типов клеток не столь велика, но также впечатляет; например, макрофаги поглощают за 1 ч мембранный материал, площадь которого вдвое превышает площадь их поверхности, а адипоциты — материал, по площади составляющий 0,2 площади их поверхности. Большая часть жидкости, поглощаемой клетками, быстро выводится из них sa характерное время от 1 мин (гепатоциты) до 20 мин (адипоциты). Возможно, между плазматической мембраной и периферическими эндосомами устанавливается динамическое равновесие, причем на долю эндосом приходится лишь около 3% общего объема клетки [1287]. Кроме того, некоторая часть инулина, поглощаемого i епатоцитами, поступает в гораздо медленнее обменивающийся внутренний пул (характерное время обмена -1 ч), что, возможно, отражает попадание его в другие внутренние вакуоли, например в лизосомы.

Эти данные свидетельствуют об исключительной динамичности поверхности мембран. Бретчер [146] обратил внимание на то, что если бы какой-то участок плазматической мембраны включался в одном месте клеточной поверхности и появлялся в другом, то это означало бы, что существует однонаправленный мембранный по-

416 Глава 9

ток. Это представление было положено в основу модели, объясняющей механизм амебоидного движения клетки таким же образрм, как и «кэпииг» поверхностного антигена [146]. Кэпинг наблюдается как у лимфоцитов, так и у других типов клеток; он инициируется агрегацией белков плазматической мембраны, обычно путем связывания мультнвалентного лиганда (антитела) с каким-то компонентом клеточной поверхности. Связанный компонент агрегирует с образованием «очажков», которые затем объединяются в один крупный агрегат — кэп. Далее происходит поглощение белковых агрегатов. Было высказано предположение [146], что первые белковые агрегаты пассивно увлекаются предполагаемым массовым мембранным потоком, при этом они концентрируются около места ин-тернализацин. Альтернативная точка зрения, гораздо более распространенная, заключается в том, что кэпинг — это активный процесс, протекающий при прямом участии элементов цитоскелета [744]. Интересно отметить, что ганглиозиды также можно индуцировать для образования кэпа на лимфоцитах [1370].

9.4.2. СОРТИРОВКА КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕКСА РЕЦЕПТОР-ЛИГАНД

В результате эндоцитоза и быстрого рециклирования плазматической мембраны происходит поглощение не только жидкостей. Одна из основных функций этого процесса состоит в облегчении поглощения внеклеточных белков. Большинство рецепторов, перечисленных в табл. 9.2, которые концентрируются в окаймленных ямках, связываются с такими макромолекулярными лигандами, как гликопротеины, липопротеины низкой плотности или иммуноглобулины. Кроме того, имеются рецепторы для факторов роста и таких гормонов, как ФРЭ или инсулин, когда в результате рециклирования плазматическая мембрана быстро освобождается от комплексов гормон—рецептор, заменяемых новосинтезированными рецепторами. Структурные детерминанты, которые опосредуют связывание этих рецепторов с окаймленными ямками, неизвестны. Установлена первичная структура нескольких таких рецепторов, при этом никакого сходства между ними не выявлено. Все они имеют единственный трансмембранный сегмент, но у одних N-конец обращен в цитоплазму, а у других ориентирован в противоположном направлении. В нескольких случаях было показано, что цитоплазматический домен рецептора необходим для того, чтобы рецептор оставался в незамкнутых ямках, но об этом известно очень мало.

Судьбы рецептора и лиганда после^их поглощения клеткой различаются. Исходя из этого можно выделить четыре основные группы систем лиганд—рецептор (табл. 9.2 и рис. 9.7).

Группа I. Рецептор возвращается к поверхности клетки, лиганд

Клеточная поверхность 417

Группа I

Апикальная мембра на

Гиуппа И

Группа ш

Группа IV

'асщеплсние

Миганд

Лиганд

рН 7,5 Рщеп- * IgA тор polylg

Рис. 9.7. Различные типы эндоцитозной сортировки [1024]. Группа I: рецептор реци-клируется, лиганд разрушается (пример — рецептор ЛНП). Группа И: и рецептор, и лиганд разрушаются в лизосоме (пример — рецептор ФРЭ). Группа 111: трансцитоз (пример — IgA/IgM-рецептор и IgG-рецептор, соответствующие противоположным направлениям переноса лиганда). Группа IV: рецептор возвращает модифицированный лиганд обратно на клеточную поверхность (пример — ферритин, апоферритии).

направляется в лизосомы. Примерами служат ЛНП- и асиалоглико-протеиновый рецепторы.

Группа II. Как рецептор, так и лнганд направляются в лизосомы. Примерами являются ФРЭ- и инсулииовый рецепторы.

Группа III. Рецептор остается связанным с лигандом, а лиганд направляется в другой домен плазматической мембраны. Это явление называется трансцитозом [1024] и характерно для рецепторов иммуноглобулинов в поляризованных эпителиальных клетках. После такого клеточного «транзита» рецепторы для IgA и IgM подвергаются протеолитическому расщеплению, тогда как рецептор для IgG при некоторых условиях может использоваться вновь.

Группа IV. И рецептор, и лнганд возвращаются к одному и тому же домену плазматической мембраны. Наиболее полно охарактеризованным примером такого рода служит трансферриновая система, в которой после поглощения комплекса трансферрин—железо и удаления железа комплекс апотрансферрин—рецептор возвращается к клеточной поверхности.

418 Глава 9

Скорости всех этих процессов достаточно велики [1447]. Обычно время жизни рецепторов, возвращающихся к клеточной поверхности, составляет всего 3 — 6 мнн, а время полного оборота рецептора — около 15 — 25 мин. В равновесном состоянии на клеточной поверхности обнаруживается около 65 — 75% рецепторов, а остальная их часть находится на разных внутриклеточных мембранах. Полный анализ равновесной кинетики поглощения и процессинга может быть проделан с привлечением констант скоростей для каждого элементарного шага [1045],

Одной из характерных особенностей механизма сортировки является его удивительная точность. Например, трансферриновый рецептор почти всегда находится в базолатеральной, но не в апикальной мембране поляризованных эпителиальных клеток. Вероятность его ошибочного включения в апикальную мембрану составляет лишь -0,1%, т. е. достаточно мала для сохранения полярности мембран этих клеток [471]. В других системах, где по экспериментальным данным вероятность ошибки достигала 4%, для корректировки локализации рецепторов был необходим дополнительный этап сортировки.

Механизм сортировки должен быть весьма изощренным. По-видимому, различные комплексы рецептор—лиганд поглощаются вместе в одних и тех же частях окаймленных везикул, а сортировка внутри везикул происходит за несколько мннут [1395]. Например, рецептор для асналогликопротеинов перемещается в латеральном направлении внутри эндосомной системы и концентрируется в трубочках и маленьких везикулярных компонентах, но не в крупных везикулах [511]. Возможно, крупные эндосомные везикулы, практически лишенные этого рецептора, но содержащие гликопротеино-вый лиганд, сливаются затем с лизосомами. Однако трубочки, содержащие рецептор, возвращают его к клеточной поверхности (рис. 9.7). В этом случае сортировка несомненно происходит внутри эндосомного (или прелизосомного) комплекса органелл.

Какой механизм лежит в основе быстрой сортировки макромолекул? Конечно, должны существовать особые структурные «сигналы», приводящие к компартмеитализации специфических рецепторов и лигандов. Единственным известным сигналом является ман-нозо-6-фосфат, который присутствует на ферментах, направляющихся в лизосомы [778]. Маннозо-6-фосфатспецифичные рецепторы находятся в комплексе Гольджи, где они направляют иовосинтезированные белки в лизосому (экзоцитозный путь; разд. 10.2), а также иа плазматической мембране, где они вызывают секрецию таких ферментов во внешнюю среду (эндоцитозиый путь).

Помимо специфических структурных сигналов сортировки большую роль играет закисление внутриклеточных везикулярных ком-

Клеточная поверхность 419

партментов [956]. Значение рН в эндоцитозных пузырьках составляет 5,0 — 6.2 [746]. При столь низких рН происходит диссоциация комплексов рецептор—лиганд, включающих липопротеины низкой плотности, лизосомные ферменты, асиалогликопротеины, фактор роста эпидермиса и инсулин. В таких условиях от комплекса транс-феррин—рецептор отсоединяются и два атома железа, хотя в этом случае апотрансферрин остается связанным со своим рецептором.

У некоторых оппортунистических вирусов и токсинов выработались механизмы проникновения в клетку, основанные на закислении везикул [966]. Например, дифтерийный токсин связывается с каким-то неидентифицированным рецептором на клеточной поверхности и затем поглощается эндоцитозным путем. Понижение рН эндоцитозных везикул индуцирует в молекулах токсина конформационное изменение, что приводит к его проникновению через везикулярную мембрану и позволяет ферментативно активной части токсина достичь цитоплазмы. рН-индуцируемое конформационное изменение может вызвать образование трансмембранной поры (см. разд. 8.6.1). Многие вирусы животных, имеющие оболочку, тоже попадают в цитоплазму путем эндоцитоза. Низкое значение рН, отмечаемое в эндоцитозных везикулах, индуцирует конформационное изменение в гликопротеинах, входящих в состав шиловидных структур вирусных мембран, что облегчает как слияние мембраны вируса с мембраной эндоцитозной везикулы, так и доставку вирусного генома в цитоплазму. Примерами могут служить вирус леса Семли-ки и вирус гриппа. Различные аспекты процесса слияния мембран обсуждаются в разд. 9.5.

рН во внутриклеточных компартментах может повышаться при добавлении слабых оснований (например, примахина, хлорохина, метиламина и хлорида аммония) или ионофоров (таких, как моненсин) [956]. Слабые основания могут проходить через липидный бислой в незаряженной форме и протонироваться в кислом содержимом компартмента. В результате рН в компартменте может повышаться на 1—2 единицы и блокировать многие рН-зависи