Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

единицы Na +/К +-АТРазы. Было высказано предположение, что эта субъединица имеет одну или четыре трансмембранные а-спирали [1630, 1111].

В заключение отметим, что благодаря легкости клонирования этих мембранных АТРаз и возможности использования разных экспериментальных подходов эти системы являются отличным объектом для применения к ним направленного мутагенеза и других генетических методов. Подобные методы уже применяются в исследованиях FiFo-АТРаз (см. следующий раздел).

8.4.2. АТРазы FtFq-ТИПА ИЗ МИТОХОНДРИЙ, ХЛОРОПЛАСТОВ И БАКТЕРИИ [1134, 128, 654]

Большинство бактерий, а также митохондрии и хлоропласты содержат родственные АТРазы FiFo-типа, которые используют трансмембранный протонный электрохимический градиент для синтеза АТР из ADP и неорганического фосфата. В физиологических условиях эти ферменты являются АТР-синтазами. Они содержат от 8 (?. coli) до 13 (митохондрии сердца быка) различных субъединиц и, таким образом, являются гораздо более сложными структурами, чем АТРазы EiE2-THna из плазматических мембран. АТРазы FiFn-типа состоят из двух частей: 1) гидрофильного глобулярного Fi-комплекса, содержащего места связывания нуклеотидов и функционирующего в качестве АТРазы, и 2) мембраносвязанного F0-kom-плекса [654], который функционирует как Н+-проводящий канал. F,- и Fo-комплексы могут отсоединяться друг от друга, а после очистки их можно реконструировать с восстановлением функциональной активности.

F,-комплекс из Е. coli содержит пять субъединиц в стехиометрии <*1/3,7°?- Между тремя парами а/3 в составе Fi наблюдается асимметрия, возникающая, по всей вероятности, в результате асиммет-

Поры, каналы и переносчики 387

ричиых взаимодействий с другими субъединицами. В составе каждого комплекса имеется по три каталитических центра, и для быстрого оборота фермента необходимо, чтобы АТР был связан более чем с одним местом связывания. Для объяснения механизма катализа были построены различные модели с чередованием мест связывания, в частности модель, согласно которой в ходе катализа происходит физическое вращение частей фермента [256]. Возможно, в связывании Fi - и Fo-компонентов фермента в мембране участвуют 5- и е-субъединицы.

Fo-комплекс из фермента Е. coli устроен достаточно просто, он содержит только три субъединицы в стехиометрии а\ЬгС\0. Все эти субъединицы необходимы для формирования Н+-проводящего канала [1301]. Остается неясным, можно ли рассматривать F0 как канал в том смысле, как мы его понимаем в этой главе [859]. Полагают, что Н +-проводящая часть F0 образована а-спиралями из множественных копий с-субъедииицы. По всей вероятности, эта субъединица содержит пять трансмембранных а-спиралей, в то время как а- и Ь-субъединицы — по одной. Результаты, полученные с помощью генетических методов, согласуются с предположением, согласно которому погруженные в мембрану части всех трех субъединиц играют важную роль в обеспечении протонной лроводимости.

Изучение этой системы показывает нам, сколь успешным может быть применение генетических методов для исследования строения мембранных белков, для которых отсутствуют кристаллографические данные высокого разрешения. Очень важно выяснить, приводит ли замена единственной аминокислоты в таком белке к конфор-мационным изменениям, которые скажутся на катализе. По-видимому, результат такой замены сильно зависит от природы переносчика. Например, как мы уже обсуждали, очень обнадеживающими в этом отношении являются данные, полученные для лактоэопермеазы. Очевидно, в следующем десятилетии в изучении взаимосвязи между структурой и функцией мембранных белков главную роль будут играть различные генетические методы, в частности направленный мутагенез.

Рассмотрим результаты, прлученные к настоящему времени для FiFo-АТРазы из Е. coli.

1. Наличие многочисленных мутантных по е-субъединице форм позволяет идентифицировать участок, являющийся, по всей вероятности, каталитическим нуклеотидсвязывающим доменом [1123, 1122]. Исследование мутантных форм показало также, что между а- и /3-субъединицами имеется конформационное сопряжение [1377].

2. Показано, что мутантные по е-субъединице формы неспособны к сопряжению транспорта Н + с катализируемой комплексом F, АТРазной активностью [257], а также к связыванию комплексов F, и F0 [764].

388 Глава 8

3. Показано, что определенные аминокислотные остатки в субъединицах а [178], b [701] и с [424] опосредуют протонную проницаемость; имеющиеся генетические данные позволяют предположить, что субъединица b непосредственно контактирует в мембране с субъединицами а и с [801, 800].

Связаны ли все эти явления с локальными или глобальными конформационными изменениями, покажут дальнейшие исследования. Пока же мы не может сказать определенно, как происходит сопряжение гидролиза АТР и транспорта Н+ при работе АТРазы FiFo-типа, а также с чем связана протонная проводимость.

Важными в этом отношении могут оказаться данные о том, что цитоплазматическая мембрана анаэробной бактерии Propionigenium modestum содержит Na+-зависимую АТРазу FiF2vrHna [822]. Если этот фермент работает как первичный АТР-зависимый Na+-насос, то логично предположить, что механизм функционирования Н+ -АТРазы и Na +-АТРазы одинаков. Например, это позволит исключить модели прямого сопряжения.

8.4.3. ТРИ ДРУГИХ КЛАССА ПЕРЕНОСЧИКОВ

Помимо АТР-зависимых активных переносчиков Е,Е2- и F,F0-типов есть еще три класса активных переносчиков, использующих свободную энергию гидролиза макроэргических фосфатных связей. О реальных механизмах транспорта или сопряжения в этих системах известно немного. Отметим несколько интересных их особенностей.

1. Бактериальные фосфотрансферазы [548]. Этот комплекс был обнаружен только в бактериях; он катализирует транспорт Сахаров, таких, как глюкоза и маннитол. Уникальной особенностью этой системы является то, что транспорт сахара сопровождается его фосфорилированием. Получаемое фосфатное производное сахара уже не может служить субстратом для переносчика в бактериальной мембране, и таким образом предотвращается обратный поток сахара через эту систему. Вспомним, что в переносчиках EiE2-THna фосфорилирование переносчика стабилизирует форму с низким сродством к переносимому веществу (например, Са + или Na+), что также препятствует обратному переносу транспортируемых веществ.

Конечным донором фосфата в фосфотрансферазной системе является фосфоенолпируват. Фосфат переносится специфической последовательностью растворимых фосфорилированных интермедиатов в цитоплазму к мембраносвязанному транспортному белку, называемому фермент II или ЕН. Существует группа ферментов ЕП-типа, специфичных к разным сахарам, но обладающих сходной первичной структурой [132]. По всей вероятности, внутри мембраны

Поры, каналы и переносчики 389

ферменты ЕП-типа образуют димеры [1388]. Высказывалось предположение, что они формируют каналы [1232]. Эти белки чувствительны к реагентам, действующим на сульфгидрильные группы, и к окислению, что может играть важную роль в условиях in vivo. Немного известно о том, каким образом фосфорилированные ферменты ЕП-типа осуществляют транспорт и фосфорилирование Сахаров. Разумной представляется модифицированная модель с чередованием конформации и единственным местом связывания.

2. Бактериальные периплазматические транспортные системы [31]. В дополнение к системам симпорта (катион — сахар) и фосфотрансферазной системе бактерии имеют еще одну систему активного транспорта растворимых веществ, которая используется для различных аминокислот и Сахаров. Так, охарактеризованы системы, специфичные к гистидину (S. typhimurium) и мальтозе (Е. coli). К сожалению, биохимические данные, которые могли бы дополнить интенсивные генетические исследования мембраносвязанных компонентов этих систем, весьма немногочисленны. Уникальной особенностью этих систем является то, что они содержат субстратспеци-фичные связывающие белки, локализованные в периплазматиче-ском пространстве. Роль этих белков заключается в связывании переносимого вещества и последующей передаче его собственно транспортирующей системе цитоплазматической мембраны. Специфичность системы определяется как связывающими белками, так и мембраносвязанными компонентами. Цитоплазматический мембранный компонент содержит три субъединицы, две из которых являются трансмембранными белками, а третья, по всей вероятности, прочно связана с цитоплазматической стороной мембраны. Как оказалось, этот третий компонент транспортного комплекса содержит место связывания нуклеотидов, где, как предполагается, происходит гидролиз АТР — реакция, являющаяся движущей силой активного транспорта. Однако прямые данные, подтверждающие эту гипотезу, отсутствуют. Практически ничего не известно о механизме транспорта, за исключением того, что для него необходим растворимый связывающий белок.

По всей вероятности, эта система аналогична транспортной системе млекопитающих, которая используется ими для выведения из клетки нежелательных лекарственных веществ и обеспечивает множественную лекарственную устойчивость [30, 1272, 508]. По-видимому, транспорт разных лекарственных веществ единственной транспортной системой опосредуется группой немембранных связывающих белков. Сходное предположение высказывалось относительно кодируемой плазмидой бактериальной транспортной системы, которая выводит из клеток арсенаты [203]. Предполагается, что эти системы также используют гидролиз АТР в качестве источника энергии, однако это не было прямо продемонстрировано.

390 Глава 8

3. Вакуолярные Н + -АТРазы [1134, 128]. В эукариотических клетках имеются Н + -АТРазы, локализованные в мембранах различных внутренних органелл (кроме митохондрий) (см. табл. 8.3). Эти АТРазы отличаются от АТРаз как FiFo-, 'так и Е|Ег-типов. В некоторых случаях функцией Н + -АТРазы является транспорт протонов внутрь той или иной органеллы для закисления ее содержимого. Например, известно, что низкий рН в эндоцитозных пузырьках необходим для отсоединения лигандов от их рецепторов, происходящего вслед за эндоцитозом (гл. 9). Хотя достоверные данные о структурном родстве этих Н +-АТРаз пока не получены, известно, что все они 1) содержат более одной субъединицы; 2) не образуют фосфорилированного интермедиата; 3) нечувствительны к ванадату; 4) транспортируют Н +. Однако все эти вопросы требуют дополнительных биохимических и структурных исследований.

8.5. Активные транспортные системы, сопряженные с процессом переноса электронов или поглощением света

Имеется несколько интересных примеров активных транспортных систем, которые используют для своей работы изменение окислительно-восстановительного состояния связанной с белком просте-тической группы (например, гема) или энергию света, поглощаемого простетической группой (ретиналем). В целом транспорт и в этом случае подчиняется закономерностям, обсуждавшимся ранее. Для его осуществления нужно стабилизировать некую нестабильную форму белка, которая является необходимым промежуточным соединением в транспортном цикле. Способы стабилизации могут быть различными: фосфорилирование белка или даже связывание АТР, о чем мы уже говорили. В этом разделе мы остановимся на двух других способах.

8.5.1. ЦИТОХРОМ с-ОКСИДАЗА: ПРОТОННЫЙ РЕДОКС-НАСОС [502]

Этот белок является наиболее ярким примером фермента, который, функционируя как ионный насос, сопрягает ионный транспорт (Н +) и реакции переноса электронов. Оксидаза катализирует окисление цитохрома с, локализованного в межмембранном пространстве митохондрий, и восстановление Ог до воды. В этой реакции участвуют четыре иоиа Н + на каждую молекулу Ог; протоны поступают из матрикса митохондрий. Соотвтетствеино на каждый электрон, проходящий через систему, через внутреннюю митохондриальную мембрану переносится по меньшей мере один протон

Поры, каналы и переносчики 391

[78]. Фермент содержит две простетические группы гема а, а также два или три атома меди и один атом цинка [1384]. Цитохром с-оксидаза — очень консервативный фермент, мало изменившийся в ходе эволюции. Ферменты, сходные с митохондриальной цитохром с-оксидазой, обнаруживаются во многих бактериях. Субъединичный состав комплекса сильно варьирует: он содержит от двух субъединиц у некоторых бактерий до 12 в оксидазе митохондрий сердца быка. По всей вероятности, в переносе Н+ непосредственно участвует одна субъединица (III), ио окончательно этот вопрос еще не выяснен [1183]. Согласно данным электронной микроскопии, оксидаза не только пронизывает бислой, ио и выходит на внешнюю поверхность мембраны. К сожалению, до сих пор окончательно не установлен не только механизм ионного транспорта, но и расположение простетических групп в ферменте.

Для описания работы оксидазы можно использовать очень простую модель четырех состояний [105]. В этой модели постулируется, что место связывания Н+ доступно с одной стороны мембраны, когда ион металла в составе простетической группы восстановлен, и обращено к противоположной стороне мембраны, когда он окислен. Значения рК (т. е. константы связывания Н + ) в окисленном и восстановленном состояниях также могут различаться. Существенно, что в ходе реакций переноса электронов происходит поочередная стабилизация двух коиформации фермента, в которых место связывания Н+ обращено к разным сторонам мембраны. Однако механизм этого явления на молекулярном уровне не установлен.

В заключение следует отметить, что существует по меньшей мере один пример редокс-зависимого транспорта Na+ [1473]. Это означает, что такого рода системы не ограничиваются переносом только ионов Н + .

8.5.2. БАКТЕРИОРОДОПСИН: Н +-НАСОС, ИСПОЛЬЗУЮЩИЙ ЭНЕРГИЮ СВЕТА

Структура бактериородопсина подробно обсуждалась в гл. 3. Функция этого белка состоит в активном транспорте протонов через бактериальную цитоплазматическую мембрану. Поглощение света связанной простетической группой ретиналя запускает последовательность событий, которые поддаются регистрации оптическими методами. Эти реакции сопряжены с переносом двух Н + на каждый цикл работы комплекса [781]. Галородопсин, белок из той же бактерии, использует аналогичный механизм для активного транспорта Cl ~ [819]. По всей вероятности, мономерная форма бактериородопсина является самостоятельной функциональной единицей, хотя внутри мембраны он находится в виде тримера. Показано, что ретиналь локализован примерно в середине бислоя. Пред-

392 Глава 8

полагается, что для него характерен прямой механизм сопряжения [578J. Структура белка с семью параллельными а-спиралями, пронизывающими мембрану, не дает ответа на вопрос о существовании какого бы то ни было канала. Как ион Н + достигает ретиналя — неизвестно, но, без сомнения, это один из вопросов, который можно будет решить, используя методы сайт-специфического мутагенеза.

В лаборатории Кораны при помощи сайт-специфического мутагенеза были получены многочисленные мутантные формы бактериородопсина [1002, 570]. Оказалось, что большинство из них, в том числе и с замещением каждого из 11 остатков тирозина, сохраняют нормальную или близкую к нормальной транспортную активность [1002]. Эти данные служат еще одной иллюстрацией ис

страница 55
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.08.2017)