Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

т транспорта Н+. Этот переносчик связывается с нуклеотидами, которые ингибируют транспорт, и его работа может регулироваться жирными кислотами.

Все три переносчика, а возможно, еще и а-кетоглутарат/малат-транслоказа [1260], имеют сходное строение; этот вывод был сделан на основе данных об их аминокислотной последовательности. Все они имеют мол. массу около ЗЗООО Да и состоят из трех гомологичных доменов, каждый из которых содержит -100 аминокислот. По всей вероятности, эти три домена образовались в результате утроения единственного гена. Была построена модель, согласно которой каждый из гомологичных доменов дважды пересекает мембрану, а вся субъединица содержит шесть трансмембранных а-спиралей. С этой моделью согласуются данные по химической модификации. Отметим, что такая структура имеет много общего с Na + -каналом, состоящим из четырех родственных гомологичных доменов. ADP/ATP-транслоказа является димером и, по-видимому, содержит единственный канал, по которому осуществляется транспорт [45]. Такой вывод основывается на результатах исследований по связыванию ингибиторов с высоким сродством (например, кар-боксиатрактилозида).

К ADP/ATP-транслоказе мы вернемся в гл. 10, в которой будем обсуждать механизм переноса этого белка из цитоплазмы, где он ситезируется, во внутреннюю митохондриальную мембрану.

8.4. Несколько примеров активных переносчиков, использующих энергию гидролиза АТР или фосо>оенолпирувата

Сделаем несколько замечаний, касающихся первичных активных переносчиков. Охарактеризовано довольно много систем, с помощью которых происходит сопряжение транспорта тех или иных веществ через мембрану с гидролизом макроэргической фосфатной связи или с другой реакцией, в ходе которой высвобождается энергия. Мы не стремимся дать подробный анализ обширной литературы по данному вопросу, а хотим лишь отметить некоторые основные особенности строения и механизма работы этих транспортных систем в контексте того, что мы уже узнали о других группах транспортных белков.

Как мы уже отмечали, в основе кинетических моделей многих первичных активных транспортных систем лежит концепция чередования конформационных изменений (рис. 8.2). При этом совер-

380 Глава 8

шенно необязательно, чтобы реакция, в ходе которой высвобождается энергия, например реакция гидролиза АТР, была прямо сопряжена с конформационным переходом, необходимым для транспорта, как это показано на рис. 8.2; важно лишь, чтобы такое сопряжение существовало с одной или несколькими стадиями кинетического цикла. Требования, предъявляемые к структуре трансмембранного «канала» первичного активного переносчика, аналогичны таковым для других переносчиков (это обсуждалось в предудыщих разделах), но здесь возникает дополнительная сложность — необходимость контроля сопряжения химической реакции, в ходе которой высвобождается энергия, и транспорта растворимого вещества.

О молекулярной структуре первичных активных транспортных систем известно даже меньше, чем о транспортных белках, обсуждавшихся ранее в этой главе. Идентифицировать группы родственных переносчиков, близких по строению и механизму работы, помогают данные об их аминокислотной последовательности, которых становится все больше (табл. 8.5). Однако достоверные данные о том, каково строение участков, непосредственно вовлеченных в транспорт веществ, отсутствуют. В основе различного рода структурных моделей активных переносчиков лежит предположение о том, что трансмембранный канал, через который транспортируются вещества, образован кластером трансмембранных амфифильных а-спиралей. Сходным образом и модели, описывающие сопряжение химических реакций и транспорта веществ, опираются на весьма немногочисленные экспериментальные данные. Модели сопряжения можно разделить на две главные группы. Согласно модели прямого сопряжения, химическая реакция оказывает непосредственное влияние на перенос транспортируемого вещества, причем этот процесс не требует значительных опосредованных белком конформационных изменений. Например, протоны, участвующие в гидролизе АТР, могли бы быть именно теми ионами, которые транспортируются через мембрану в ходе данной реакции [1286]. Для этого необходимо, чтобы участок комплекса, где протекает химическая реакция (например, гидролиз АТР), и участок связывания транспортируемого вещества были расположены очень близко друг к другу. В отличие от этого в модели непрямого сопряжения химическая реакция оказывает влияние на транспортный процесс через опосредованные белком конформационные изменения. Допускается даже, что химическая реакция и активный транспорт могут быть связаны с разными субъединицами внутри комплекса. Эти модели имеют то преимущество, что с их помощью нетрудно объяснить транспорт различных веществ (например, Na+ , Н +) одними и теми же или близкородственными белками при участии одних и тех же механизмов.

Поры, каналы и переносчики 381

Активные транспортные системы функционируют со скоростями, типичными для многих ферментов, т. е. 102—103 с" 1 в условиях насыщения. В отличие от канальных белков селективность в отношении субстрата обусловливается главным образом сродством транспортируемого вещества к активному переносчику. Более того, большинство первичных активных переносчиков обычно функционирует в условиях, когда концентрация переносимого вещества с #ис-стороны близка или немного превышает Км и лимитирующей стадией транспорта является конформационный переход белка или химическая реакция, служащая источником энергии для данной системы.

И наконец, роль первичных активных транспортных систем заключается в перемещении вещества через мембрану против его концентрационного градиента в одном направлении (цис -» транс). Поскольку переносчик после высвобождения транспортируемого вещества должен опять изменить свою ориентацию с транс на цис, необходим какой-то механизм, препятствующий возвращению на цис-сторону загруженного переносчика (т. е. обратному транспорту вещества). Следовательно, сродство активного переносчика к транспортируемому веществу должно быть| выше с г/ис-стороны (где этот субстрат при низких концентрациях связывается с переносчиком), чем с транс-стороны (где оно диссоциирует при гораздо более высоких концентрациях). Если бы это было не так, переносчик работал бы очень неэффективно при высоких концентрациях субстрата с m/юнс-стороны. В такой реакции энергия затрачивается главным образом на изменение сродства переносчика к транспортируемому веществу. Например, фосфорилирование Na + /К + -АТРазы или Са -АТРазы при помощи АТР ведет к стабилизации конформации тех переносчиков, у которых место связывания ионов обращено наружу и которые имеют низкое сродство соответственно к Na + или Са2 + . В то же время связывание АТР стабилизирует ту форму Na +/К +-АТРазы, в которой места связывания ионов, обращенные к цитоплазме, имеют низкое сродство к К* (см. следующий раздел и рис. 8.12). Следовательно, механизм сопряжения реакции, в ходе которой высвобождается энергия, и транспорта, катализируемого активными переносчиками, лучше всего рассматривать исходя из термодинамических принципов, т. е. как временную стабилизацию определенных конформации и изменение сродства к транспортируемому веществу.

Можно выделить пять групп переносчиков, которые используют свободную энергию макроэргической фосфатной связи для осуществления транспорта веществ, т. е. Природа нашла несколько путей решения этой задачи.

382 Глава 8

8.4.1. ПЕРЕНОСЧИКИ КАТИОНОВ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ (Е^г-ТИПА): АТР-ЗАВИСИМЫЕ ИОННЫЕ НАСОСЫ [1134, 1386]

Несколько про- и эукариотических ионпереносящих АТРаз составляют единое семейство и обладают сходными аминокислотными последовательностями и механизмами переноса ионов (табл. 8.5). Наиболее полно охарактеризованы Na + /K+-ATPa3a из

Таблица 8.5. Некоторые АТРазы, участвующие в транспорте ионов [1134]

I. Е\Ег-типа Транспортируемые ионы Н +

Н*

К + Н + /К +

NaVK + Са2* Са2 +

И. FiFo-muna Транспортируемые ионы Ы Ы

Источник

Низшие эукариоты (дрожжи, грибы) Высшие эукариоты Растения Животные

Е. coli, S. faecalis Высшие эукариоты (животные) То же

Источник

Мембрана

Плазматическая

То же Плазматическая (опухоль) Цитоплазматическая Плазматическая

Саркоплазматическая Мембрана

Большинство бактерий Цитоплазматическая Эукариоты Животные, растения

Н'

III. Вакуолярного

типа Транспортируемые

ионы Н +

Н*

н*

н + н*

н*

н1

Растения

Источник

Низшие эукариоты (дрожжи, грибы) Высшие эукариоты

(растения) Высшие эукариоты (животные) То же

Внутренняя митохоидриальная Тилакоиды хлоропластов

Мембрана

Вакуоли

Тонопласты

Лизосомы

Эндосомы Секреторные

гранулы Запасающие гранулы Окаймленные везикулы

Поры, каналы и переносчики 383

плазматической мембраны животных клеток и Са2 + -АТРаза из саркоплазматического ретикулума (см. разд. 6.5). Большинство ферментов этой группы представляют собой единый полипептид с мол. массой 100 000; исключение составляет Na +/К +-АТРаза, выделенная из нескольких источников, которая содержит вторую, меньшую субъединицу с неизвестной функцией. Эти переносчики ингиби-руются ванадатом и прямо фосфорилируются АТР с образованием фосфорилированного интермедидата, играющего важную роль в транспорте (см. рис. 8.12). Катионные переносчики этой группы значительно различаются по ионной специфичности (см. табл. 8.5). Неодинакова и стехиометрия транспорта. Например, Са2 +-АТРаза переносит 2Са2 + /АТР в полость саркоплазматического ретикулума, в то время как Na+/К +-АТРаза переносит 3Na+ наружу и 2К + в цитоплазму через плазматическую мембрану. При этом различия в работе АТРазы касаются не только стехиометрии и природы переносимых ионов, но также и того, что Са2 +-АТРаза способна переносить ионы лишь в одном направлении, в то время как Na + /K+-АТРаза делает это в обоих направлениях.

Рис. 8.12. Кинетическая схема для Na +/К +-АТРазы. Для Са2 + -АТРазы можно использовать тот же механизм, за исключением того, что вслед за лефосфорилированием ег-Р переносчик возвращается в конформацию Ei в незагруженном состоянии (пунктирная линия).

384 Глава 8

Название «фермент Е1Е2-ТИГЩ» было введено в работе, посвященной Na +/К +-АТРазе. Как показали исследования, этот белок существует по меньшей мере в двух различающихся конформациях, для которых характерны разное связывание субстратов и неодинаковая подверженность мягкому протеолизу [39, 714]. Форма Е, соответствует конформации, в которой места связывания ионов обращены в сторону цитоплазмы (высокое сродство к Na + , низкое — к К +) и которая обладает высоким сродством к АТР. Места связывания ионов в фосфорилированной форме Е2 обращены наружу (высокое сродство к К + , низкое—к Na + ). На рис. 8.12 изображен транспортный цикл, в котором участвуют две ненагруженные формы переносчика и две нагруженные, Ег (2K + )CB(U и Ei (3Na+)CB(l3, со «спрятанными» внутри насосного комплекса ионами. Изучение связывания К + фосфорилированной формой переносчика (Ег-Р) показало, что оно происходит в двух разных местах [446].

Отметим основные особенности каталитического цикла.

1. Ei-форма связывает три иона Na+ с цитоплазматической стороны мембраны и затем взаимодействует с АТР, образуя фосфори-лированный фермент. Фосфорилируется при этом специфический аспартат, консервативный в этой группе ферментов.

2. После отсоединения ADP ионы оказываются «спрятанными» внутри комплекса.

3. Фосфорилирование белка стабилизирует конформацию с низким сродством к Na + ; при этом места связывания ионов обращены наружу. Это способствует переходу Ei-P -» Ег-Р, в результате которого и осуществляется перенос.

4. В форме Ег-Р места связывания ионов обращены во внеклеточную среду; эта конформация обладает высоким сродством к К+, который связывается, катализирует дефосфорилирование и остается «спрятанным» внутри комплекса. Обратите внимание, что Na+ необходим для быстрого фосфорилирования, а К+ — для быстрого дефосфорилирования. Ванадат связывается с формой Е2, возможно, как некий аналог переходного состояния фосфата. У других ферментов Е^г-типа, например Са2 + -АТРазы [1376], форма Ег-Р дефосфорилируется и переходит в форму Ei, которая в свою очередь переходит в незагруженную форму.

5. Лимитирующей стадией каталитического цикла является, по всей вероятности, освобождение К+ и переход его из связанного с ферментом состояния в свободное. Этот процесс стимулируется связыванием АТР с сайтом, обладающим низким сродством [447]. Следовательно, АТР выполняет две разные функции, выступая в качестве субстрата и аллостерического эффектора. Сколько мест связывания АТР имеет фермент, пока неясно.

Определена аминокислотная последовательность нескольких АТРаз Е|Е2-типа, включая Na+/К+-АТРазу (а-субъединица) из не-

Поры, каналы и переносчики 385

Рис. 8.13. Теоретическая структурная модель Са2 + -АТРазы [134]. Фермент содержит 10 трансмембранных а-спиралей, 5 дополнительных а-спиралей, образующих «ножку», и объемную глобулярную часть с цитоплазматической стороны, состоящую из трех доменов. Буквами T! и T2 отмечены участки, подвергающиеся протеолитическо-му расщеплению. На врезке показано распределение заряженных аминокислотных остатков, которые, как предполагается, расположены внутри мембраны или вблизи нее: отрицательные (D, Е) и положительные (К, R, Н).

скольких источников [1337, 733, 734], Са2 + -АТРазу [902, 134], Н + -АТРазу из плазматической мембраны дрожжей [1327] и Neurospora crassa [572, 3] и К+-АТРазу из S. faecalis [1362]. Исходя из профилей гидрофобности, были построены модели, согласно которым эти белковые комплексы содержат 6, 8 или 10 трансмембранных а-спиральных сегментов (рис. 8.13). Некоторые участки полипептидов, в том числе и сегмент; содержащий сайт фосфорилирования, в значительной степени гомологичны. Все белки имеют большую гидрофильную петлю, содержащую домены, с которыми, по всей вероятности, связываются нуклеотиды и где происходит фосфорилирование [902].

У Са2 * -АТРазы один расщепляемый трипсином сайт, чувствительный к конформационному переходу Е| -¦ Ег, находится в «трансдукционном» домене (рис. 8.13) [35]. Исследовалось также связывание Са2 + с ферментом; было высказано предположение, что транспорту Са2+ предшествует связывание двух ионов Са2+ с опре-

386 Глава 8

деленными участками внутри белкового комплекса [1433, 678]. По всей вероятности, у Са2 +-АТРазы места связывания Са2+ с высоким сродством располагаются на значительном удалении от места связывания нуклеотидов [1373], однако эту гипотезу нужно еще проверить. Основные особенности строения Са2 +-АТРазы, представленные на рис. 8.13, согласуются с данными электронной микроскопии, согласно которым этот белковый комплекс сильно выступает из бислоя в цитоплазму [1440]. Вероятно, в условиях in vivo АТРазы Е|Ег-типа агрегируют, образуя по меньшей мере димеры, но, как мы уже говорили в гл. 3, подтвердить данное предположение экспериментально очень трудно. Тем не менее очевидно, что мономеры также способны к катализу, по крайней мере в некоторых случаях [528, 1518].

Определена аминокислотная последовательность меньшей /3-субъ

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.04.2017)