Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

молекулы воды.

О молекулярной структуре этого канала известно больше, чем о структуре какого-либо иного канала. И все же, к сожалению, не выработано единой точки зрения на то, как построен данный канал, хотя было создано много достаточно детальных моделей [663, 1399, 564]. Большой вклад в исследование этого вопроса внесли работы с использованием методов молекулярной генетики. Так, при помощи клонирования генов каждой из субъединиц nAChR-канала из нескольких источников были определены аминокислотные последовательности этих субъединиц, анализ которых выявил наличие высококонсервативных участков. В качестве потенциальных трансмембранных а-спиралей было идентифицировано до семи различных сегментов [1198]. Наиболее интересен один из них, обозначаемый как М5 или МА; он может образовывать амфифильную спираль с заряженными группами, расположенными с одной стороны (см. разд. 3.6). Большинство исследователей полагают, что узкая часть канала, пронизывающая бислой, построена из субъединиц, каждая из которых образует а-спираль. Ансамбль а-спиралей формирует центральную пору. Первым кандидатом на эту роль является амфифильная спираль, хотя модельные исследования с грамицидином А с очевидностью показали, что наличие заряженных групп не является необходимым условием для образования наполненного водой катионселективного канала. Экспериментальные данные о прямом участии амфифильной спирали в формировании канала отсутствуют; даже вопрос о том, является ли эта спираль трансмембранной, не решен окончательно [1198, 776]. Имеются данные, что

Поры, каналы и переносчики 367

в формировании канала участвует другая спираль, М2 [677, 664, 1022, 1456]. Эти данные были получены при изучении связывания с каналом неконкурентных антагонистов [664, 1022] и с помощью молекулярнно-генетических методов [677, 1456]. Хотя спираль М2 не является амфифильной, она может образовывать канал, аналогичный грамицидиновому или аламетициновому. Отметим, что другие члены группы нейромедиаторных рецепторов (табл. 8.2) не имеют участков, аналогичных амфифильной спирали никотинового ацетилхолииового рецептора.

В работах Нума и др. [677, 9%, 997, 1456] впервые были продемонстрированы возможности применения сайт-специфического мутагенеза при исследовании подобного рода систем. Гены, кодирующие каждую из четырех субъединиц канала, клонировали в cos-клетках обезьяны и ооцитах Xenopus и наблюдали экспрессию функциональных каналов в плазматической мембране. Для изучения работы таких каналов очень ценным оказались методы регистрации токов через одиночные каналы. Есть надежда, что с развитием подобных экспериментальных подходов мы сможем получить ответы на многие давно интересующие нас вопросы о строении каналов. Использование поликлональных и моноклональных антител поможет выявить те участки полипептидов, которые ответственны за связывание ацетилхолина (или токсина) [997, 1060, 71], а также участки, формирующие собственно канал. В настоящее время большинство исследователей полагают, что этот канал образуется из а-спиралей, как аламетициновый канал. Те же представления легли в основу модели Na+ -канала (см. ниже).

8.2.5. ПОТЕНЦИЛЗАВИСИМЫЙ НАТРИЕВЫЙ КАНАЛ [193, 79]

Потенциалзависимый натриевый канал обеспечивает быстрое увеличение натриевой проводимости, ответственное за фазу деполяризации при развитии потенциала действия в нервных и мышечных клетках. Этот канал был очищен до гомогенного состояния из нескольких источников, в частности из мозга крысы, скелетных мышц млекопитающих, сердца цыпленка и электрического органа ската Electrophorus electricus.

Очищенные каналы из Elektrophorus electricus и сердца цыпленка содержат единственную гликопротеиновую субъединицу с мол. массой -260000, в то время как каналы, выделенные из тканей млекопитающих, содержат еще одну [1277] или две [975] меньшие субъединицы с мол. массой от ЗЗООО до 38 000 (/31- и /32-субъединицы). Большую часть из этих очищенных препаратов каналов удалось встроить в плоские мембраны, при этом они сохраняли присущие им in vivo электрофизиологические и фармакологические характеристики. Для успешной реконструкции канала, выделенного из тканей

368 Глава 8

Поры, каналы и переносчики 369

млекопитающих, необходим по меньшей мере один из небольших ассоциированных белков [975].

Натриевые каналы взаимодействуют с различными токсинами, в частности с тетродотоксином, сакситоксином и а-токсином скорпиона, которые очень прочно связываются с канальными белками и могут использоваться при количественных биохимических измерениях. Присутствие этих токсинов очень важно как для биохимической очистки каналов, так и для изучения их работы in vivo. Как и канал концевой пластинки (nAChR), натриевые каналы распределены в плазматической мембране не равномерно, а собраны в кластеры (гл. 4). В мышечных клетках Na +-каналы сконцентрированы в районе концевой пластинки вместе с nAChR-каналами [349].

Нума с соавторами клонировали гены, кодирующие белки натриевых каналов из Electrophorus [1074] и главную субъединицу канала из мозга крысы [1076, 1075], и определили их нуклеотидную последовательность. Было показано, что белок натриевого канала из Electrophorus содержит 1820 аминокислотных остатков, организованных в четыре повторяющиеся гомологичные единицы (рис. 8.10). По мнению разных авторов, каждый гомологичный участок содержит 4, 6 или 8 трансмембранных а-спиралей [1076, 546, 565]. Некоторые из этих предполагаемых трансмембранных спиралей (сегменты S4) амфифильны и аналогичны постулированным для nAChR-канала (см. предыдущий раздел). Имеются экспериментальные данные о том, что карбоксильный конец полипептидной цепи локализован на цитоплазматической поверхности [531]; сообщалось также, что амфифильная 54-спираль является внецитоплаз-матической [961]. Однако никакой дополнительной информации, позволяющей подтвердить предложенные топологические модели, не существует. Нет также данных о том, какие участки полипептида непосредственно вовлечены в образование поры. Различные модели натриевого канала концептуально близки к моделям канала концевой пластинки в том отношении, что канал per se состоит из кластера а-спиралей, образующих центральную пору. В этом случае, однако, вместо пяти различных субъединиц мы имеем четыре гомологичных домена единственной субъединицы. По всей вероятности, специфичные группы организованы в канале таким образом, что образуется «селективный фильтр».

Предельные размеры канала можно оценить, используя метод «молекулярного сита» (см. рис. 8.9), однако при этом нельзя объяснить селективность канала по отношению к достаточно малым ионам. На рис. 8.10 приведен профиль свободной энергии для диффузии ионов Na+ через канал. Если лимитирующей стадией является дегидратация, то параметром, определяющим высоту энергетического барьера, будет геометрия тех компонентов, которые временно заменяют воду (пик В на рис. 8.10, В). Для К+ положение соот-

Рис. 8.10. Некоторые модели натриевого канала. А. Модель укладки полипептидиой цепн; показаны четыре гомологичных домеиа, каждый из которых имеет шесть траис-мембранных спиралей. Знаком + отмечен амфнфильиый сегмент 4. Б. Гипотетическая организация шести спиралей каждого домена, образующих центральный канал (вид сверху). В. Профиль свободной энергии, согласующийся с данными о потоке Na * через канал. Числа — значения энергии в единицах RT относительно основного раствора. Предполагается, что имеются три места связывания и четыре энергетических барьера. Г. Гипотетическая модель узкого «селективного фильтра», определяющего высоту барьера С. Гидратированиый ион должен последовательно пройти через положения А, В, С и D, и высота кинетического барьера будет зависеть главным образом от соотношения между расстоянием от карбоксильной группы до карбонильной и размером иона. Из работ [1076] (А,Б) и [633а] (Д,Г)

ветствующих групп не будет оптимальным, поскольку этот ион несколько больше по диаметру, а потому энергетический барьер будет выше. Напротив, для К+-селективных каналов соответствующий энергетический барьер будет минимален именно для ионов К + .

В последнее время было построено также много моделей, описывающих регуляцию работы канала при помощи трансмембранного потенциала [546, 565, 368]. В регуляции, без сомнения, участвует изменение заряда белка в ответ на наложение электрического поля. Однако никаких данных о том, какие именно участки полипептида образуют ворота или отвечают на изменение напряжения, ,не существует. Высказывается предположение, что это может быть амфифильная 54-спираль.

370 Глава 8

Данные об аминокислотной последовательности натриевого канала свидетельствуют о том, что он относится к группе потенциал-зависимых каналов (табл. 8.2). В эту же группу входят калиевый канал из Drosophila [1443] и дигидропиридиновый калиевый канал из скелетных мышц кролика [1431]. Все эти белки содержат амфи-фильный положительно заряженный сегмент, аналогичный S4-cer-менту натриевого канала. Это еще раз подтверждает вывод о том, что данный сегмент участвует в регуляции работы канала, отвечая на изменение напряжения на мембране. Отметим, что как натриевый канал из тканей млекопитающих, так и кальциевый канал следующий раздел) имеют субъединицы, функции которых неизвестны.

8.2.6. КАЛЬЦИЕВЫЙ КАНАЛ [992, 1470]

Са2 +-селективные каналы очень широко распространены в возбудимых клетках — нервных и мышечных, а также в большинстве других типов клеток. Некоторые Са2 +-каналы отвечают на изменение напряжения на мембране, а работа других регулируется опосредованно с помощью рецепторов (гл. 9). Обычно концентрация ионов Са2+ в цитоплазме не превышает 10"7 М, что в 10000 раз ниже, чем концентрация ионов Са2+ вне клетки. Из-за этих условий и в отличие от Na + - и К + -каналов открывание Са2 + -канала может приводить к значительным изменениям концентрации этого иона в цитоплазме, что в свою очередь индуцирует разнообразные биохимические события. Например, потенциалзависимое увеличение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме приводит к высвобождению нейромедиаторов (таких, как ацетилхолин из пресинаптической мембраны).

Исходя их фармакологических данных, была проведена классификация Са2 +-каналов. Для очистки и дальнейшей харктеристики каналов очень полезными оказались органические блокирующие агенты с высоким сродством к каналам. Единственный класс Са2 + -каналов, охарактеризованных биохимически, — это потенциалзави-симые каналы, которые блокируются различными органическими соединениями, в частности производными дигидропиридииа. Эти каналы были выделены из сердечной и скелетной мышц и оказались одинаковыми [241, 1422]. Они состоят как минимум из двух субъединиц с мол. массой 140000 и 30000. Большая субъединица была клонирована и секвенирована и оказалась структурно близка к потенциалзависимому натриевому каналу [1431].

8.2.7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Появляется все больше данных, свидетельствующих о сходстве структуры различных каналов и пор. В основе всех этих систем ле-

Поры, каналы и переносчики 371

жит заполненная водой пора, выстланная изнутри полярными группами. Пора может быть образована или а-спиральными, или /3-структурными элементами. Чтобы транспорт осуществлялся с высокой скоростью, в канале не обязательно должны присутствовать места связывания, обладающие высоким сродством к переносимым веществам, поскольку селективность определяется высотой энергетических барьеров, а не глубиной впадин (см. рис. 8.1). Селективность каналов можно в большинстве случаев объяснить тем, что в нескольких ключевых местах располагаются специфические аминокислотные остатки, определяющие характер тех веществ, которые могут проходить через канал. Возможно, воротные механизмы различных каналов также имеют много общего, но экспериментальные данные по этому поводу пока отсутствуют.

Как мы увидим позже, аналогичные структурные свойства можно обнаружить и у других транспортных белков.

8.3. Некоторые унипортеры, симпортеры и антипортеры

К настоящему времени достаточно хорошо охарактеризовано несколько систем, катализирующих транспорт одного или более растворимых веществ. При этом скорость переноса с помощью этих белковых комплексов гораздо ниже, чем даже через наиболее «медленные» каналы. В данном разделе мы рассмотрим переносчик глюкозы и анионный переносчик (белок полосы 3) из мембраны эритроцита, лактозопермеазу из Е. coli и группу митохондриальных переносчиков. Транспортные функции этих белков весьма разнообразны: они катализируют облегченную диффузию одного какого-то вещества, симпорт Н + и сахара, в результате чего происходит накопление сахара в клетке, и антипорт растворенного вещества. Отметим некоторые общие свойства этих процессов.

1. В некоторых случаях эти транспортные белки являются оли-гомерами, обычно димерами [763]. Однако, по-видимому, только у митохондриальных переносчиков (например, у системы обмена ATP/ADP) канал образуется из структурных элементов разных мономеров. Во всех других случаях, по всей вероятности, каждая субъ-едииица функционирует независимо, даже если она является частью олигомера.

2. Весьма высокая степень гомологии транспортных белков указывает иа их близкое структурное родство, хотя они существенно различаются как по субстратной специфичности, так и по функциям (см. табл. 8.2). Это позволяет предположить, что для широкой группы функционально различных переносчиков характерны общие транспортные механизмы.

372 Глава 8

3. В большинстве случаев для анализа работы транспортных белков можно с успехом использовать модели с чередованием конформационных состояний, аналогичные модели, схематически представленной на рис. 8.2. При этом лимитирующей стадией является конформационное изменение с той стороной мембраны, где находится место связывания.

4. В большинстве случаев сродство переносчика к транспортируемому веществу не зависит от того, к какой стороне мембраны обращено место связывания. Однако для первичных активных транспортных систем (см. разд. 8.4) наблюдается иная картина.

5. Все рассматриваемые здесь переносчики обычно чувствительны к реагентам, действие которых направлено на сульфгидрильные группы. Однако это не обязательно должно означать, что между переносчиками имеется значительное структурное сходство или они используют одинаковый механизм транспорта. Например, установлено, что ни один из восьми остатков цистеина лактозопермеазы не участвует непосредственно в транспорте. Высказывалось также предположение, что погруженные в мембрану остатки пролина распределены в транспортных белках непропорционально ([133]; разд. 3.6.4), однако значение этого факта остается неясным.

8.3.1. ПЕРЕНОСЧИК ГЛЮКОЗЫ ИЗ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТА (см. также разд. 8.5)

Этот переносчик охарактеризован наиболее полно из всех белков, катализирующих диффузию единственного вещества через мембрану. Он переносит через эритроцитарную мембрану D-глюкозу, которая затем используется при гликолизе. Такие же или аналогичные переносчики глюкозы присутствуют и в других типах животных клеток. Большой прогресс в этой области исследований был достигнут благодаря секвенированию ДНК, кодирующей

страница 52
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.06.2017)