Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

механизмов работы каналов приходится прибегать к модельным построениям. Большие возможности дает использование малых молекул, способных образовывать поры в бислое. Особенно интересны в этом отношении три соединения: 1) нистатин — полиеновый антибиотик, который образует комплекс с холестеролом; 2) грамидицин А — пептид, который образует катионселективный канал, наиболее полно охарактеризованный из всех изученных к настоящему времени каналов; 3) аламетицин — пептид, который образует регулируемый напряжением воротный канал. Строение последних двух каналов было описано в разд. 3.7.1.

Нистатин и амфотерицин В [762, 118] (см. разд. 7.1.2)

Структурные формулы этих сходных полиенов приведены на рис. 8.6. Когда к содержащим стерол плоским мембранам с одной стороны от них добавляют нистатин, происходит увеличение мембранной проницаемости для воды, одновалентных ионов и небольших неэлектролитов. Неэлектролиты, ббльшие, чем глюкоза, пройти через канал не могут. Это говорит о том, что диаметр поры составляет около 8 А. На рис. 8.6 представлена модель канала, согласно которой от 8 до 10 молекул полнена образуют цилиндрическую структуру, в которой гидроксилированные сегменты каждой молекулы обращены внутрь, образуя заполненную водой пору. Наружная поверхность такой структуры неполярна, при этом между каждой парой молекул нистатина имеется пространство для молекулы стерола. Проводимость канала относительно низка, 5 пСм в 2 М КС1. Когда нистатин добавляют к плоской мембране с обеих сторон, две такие цилиндрические структуры, по-видимому, объединяются, образуя в два раза более длинный канал.

Необходимо отметить, что эта порообразующая молекула является амфифильной, поскольку обладает полярным и неполярным

354 Глава 8

Поры, каналы и переносчики 355

Рис. 8.6. Структурные формулы нистатина и амфотерицина В и канал, образуемый в мембране этими полиеиовыми антибиотиками [762, 959а]. Выступы внизу канала — аминосахара, а затененные поверхности внутри канала — гидрофильные полигидрок-сильные участки молекулы. Наружная поверхность канала абсолютно иеполярна.

участками. Полярная часть образуется из последовательно расположенных гидроксильных и карбонильных групп. Порообразующий комплекс, по-видимому, стабилен внутри бислоя. Обе эти структурные особенности характерны для большинства каналообразующих белков. Отметим, однако, что структура нистатиновой поры является гипотетической, хотя построена она на вполне разумных положениях и согласуется с экспериментальными данными.

Грамицидин А [633, 751, 1411] (разд. 3.7.1)

Канал, образуемый грамицидином А — гидрофобным пептидом из чередующихся L- и D-аминокислот, — охарактеризован к настоящему времени наиболее полно. Исходя из имеющихся экспериментальных данных, была построена модель канала (рис. 3.12). Согласно модели, канал образован двумя молекулами грамицидина А, расположенными голова к голове в /3(L, 0)-спнральной конфигурации. В результате чередования L- и D-аминокислот образуется спираль, в которой все боковые цепи располагаются снаружи, а карбонильные группы остова — внутри канала. Этот тип спирали не встречается больше ни в каких белках и образуется из-за необычного чередования стереоизомеров аминокислот в грамицидине А. С

этой точки зрения грамицидин А является плохой структурной моделью формируемых белками трансмембраниых пор. Однако во многих других отношениях канал, образуемый грамицидином А, имеет много общих черт с другими каналами и порами. Отметим следующие его особенности.

1. Грамицидин А чрезвычайно гидрофобен, он не содержит ни одной полярной аминокислоты.

2. Проводимость единичного канала, образуемого грамицидином, довольно велика. Например, в 100 мМ RbCl катионная проводимость составляет 30 пСм на канал. Впрочем, это гораздо ниже теоретической предельной величины для поры этого размера, если перенос вещества через пору лимитируется только диффузией (300 пС) [633].

3. Грамицидиновый канал является катионселективным. Небольшие неорганические и органические катионы проходят через него, в то же время проницаемость по О " равна нулю. Хотя этот анион достаточно мал, чтобы легко пройти через пору такого диаметра, он не транспортируется через грамицидиновый канал и не блокирует его. Этот факт весьма примечателен, если принять во внимание, что в грамицидине нет полярных или заряженных аминокислот. Такая селективность объясняется электростатическим отталкиванием анионов и диполей, образуемых карбонильными группами в воротах канала [1411].

4. Проницаемость канала для одновалентных катионов изменяется в следующем порядке: Cs + > Rb + > К + > Na + > Li+ ; такая же последовательность сохраняется и для свободной диффузии этих ионов в воде. Селективность, проявляемая каналом в отношении данных одновалентных катионов, невелика, она соответствует всего пятикратному изменению коэффициентов проницаемости. Энергия активации проводимости мала, около 5 ккал/моль (такое же значение характерно и для ионов, диффундирующих в воде). В этом смысле канал функционирует так, как будто он заполнен водой. Возможности свободной диффузии катионов в растворе в значительной степени зависят от электростатических взаимодействий с водой. Небольшие ионы (например, Li+) взаимодействуют с молекулами воды сильнее, чем крупные, и электростатическая поляризация вызывает замедление диффузии. Такого же рода силы, по всей вероятности, влияют и на лимитирующие стадии, когда катионы проходят через длинный узкий грамицидиновый канал.

5. Молекулы могут проходить через канал только поодиночке, поскольку его диаметр составляет всего 4 А. Следовательно, транспортируемый ион в момент вхождения в канал должен частично дегидратироваться.'Помимо переносимого катиона в канале могут находиться от пяти до семи молекул воды, и ион будет контактировать с двумя из них, находящимися спереди и сзади от него. В

356 Глава 8

канале должны присутствовать также группы, с которыми будет взаимодействовать транспортируемый ион вместо утраченных при дегидратации молекул воды. Дегидратация требует больших затрат энергии [633], поэтому скорее всего именно эта стадия будет лимитирующей.

6. Транспорт ионов через канал, образуемый грамицидином А, характеризуется при достаточно высоких концентрациях соли кинетикой с насыщением. Это указывает на то, что в канале имеется определенное число мест связывания катионов. Например, полунасыщающая концентрация для Na+ -проводимости составляет 0,31 М. Кинетические модели переноса предполагают наличие двух мест связывания, по одному у каждого входа в канал. Связывание катиона осуществляется в результате его взаимодействия с диполями, в частности с карбонильной группой остатка 11 [1411].

7. Вода проходит через канал со скоростью около 108 молекул в 1 с при низкой ионной силе. Перемещение катиона под влиянием электрического поля сопровождается переносом 5—7 молекул воды, находящихся в канале, что создает электроосмотические эффекты.

8. Открывание и закрывание грамицидинового канала происходит соответственно в результате ассоциации мономеров, образующих димер, и диссоциации димера. Время жизни димера составляет порядка Юме—10 с и зависит от липидного состава мембраны и других факторов.

9. Когда грамицидин А находится в отрицательно заряженном липидном бислое, под влиянием поверхностных зарядов может произойти увеличение локальной концентрации катиона у входа в гра-мицидиновую пору. Это значительно увеличит проводимость канала при низких концентрациях соли.

Все сказанное выше ясно показывает, почему грамицидин А является столь важной экспериментальной моделью. Многие из его свойств аналогичны свойствам, проявляемым физиологически важными каналами, такими, как ацетилхолиновый рецептор.

Аламетицин [969, 1223, 397]

Аламетицин — это один из представителей группы природных пептидов, которые образуют потенциалзависимые каналы и потому представляют собой хорошую модель для изучения регуляции работы канала с помощью трансмембранного потенциала. Молекула аламетицина состоит из 20 аминокислот, в частности, она содержит остатки а-аминоизобутирата (см. разд. 3.2.1). Основной структурной особенностью аламетицина и его гомологов является их способность образовывать а-спирали. В отличие от j3(L, D)-cnnpa-ли, образуемой грамицидином А, пространство внутри а-спирали слишком мало, чтобы через него мог пройти ион. Эксперименталь-

Поры, каналы и переносчики 357

ные данные скорее свидетельствуют о том, что до 12 молекул аламетицина агрегируют и образуют пору (см. рис. 3.13). Как отмечалось в гл. 3, когда аламетицин находится в такой конфигурации, полярные атомы оказываются внутри структуры. Отметим, что для обеспечения полярности наполненного водой канала не требуется присутствия боковых групп полярных аминокислот.

При низком напряжении (< 100 мВ) плоская мембрана, содержащая аламетицин, не проводит электрический ток. По мере увеличения напряжения до некоего критического значения аламетициновые каналы начинают проводить ток. Напряжение на мембране может быть любого знака. Проводимость единичного канала очень высока: она составляет 5000 пСм в 1 М КС1 и свидетельствует о том, что размер пор очень велик. Если предположить, что канал образуется 12 агрегированными мономерами аламетицина, то его диаметр должен быть равен 20 А, что соответствует высокой проводимости единичного канала.

Для объяснения возможного механизма регуляции работы ала-метицинового канала путем изменения напряжения на мембране разработано несколько моделей. Все они предполагают, что диполи в а-спирали, образуемые пептидными группами, суммируются и создают общий диполь, такой, что положительный заряд локализуется на N-конце молекулы, а отрицательный — на С-конце. Трансмембранный потенциал достаточно велик, чтобы при взаимодействии с этим постоянным диполем могло произойти изменение ориентации спирального пептида в мембране [969] или увеличилась эффективность его включения в мембрану [1223].

Рассмотрим простейшую модель, описывающую открывание канала при наложении поля. Согласно этой модели, под действием электрического поля увеличивается число встраиваемых в мембрану молекул аламетицина, в результате чего мономеры начинают агрегировать с образованием цилиндрического канала, причем процесс характеризуется высокой степенью кооперативности [1223]. Однако существует и другая точка зрения, согласно которой аламетицин находится в связанной с мембраной непроводящей форме уже в отсутствие напряжения и при наложении электрического поля только агрегирует с образованием канала в открытой конформации. Электрическое поле в рамках этих моделей вызывает дипольный флип-флоп-переход а-спирального пептида, стабилизируя агрегат, в котором а-спирали параллельны друг другу [969].

Аламетицин представляет собой хорошую модель, позволяющую объяснить процесс образования поры при ассоциации а-спиралей; он также дает возможность продемонстрировать на простой системе, как трансмембранный потенциал стабилизирует определенные белковые конформации и тем самым оказывает существенное влияние на проводимость канала. Такими свойствами обладают не

358 Глава 8

только пептиды типа аламетицина. В качестве примера можно привести синтетические пептиды [723] и мелиттин [1524].

8.2. Несколько примеров пор и каналов [377]

В последнее время достигнуты большие успехи в определении строения пор и каналов на молекулярном уровне. Выявляются некоторые общие структурные элементы этих образований. Анализ аминокислотных последовательностей соответствующих молекул указывает на существование структурно родственных групп ионных каналов (табл. 8.2). Особенно ценным в этих исследованиях оказался метод реконструкции изображения; с его помощью удалось не только визуализовать отверстия в мембране, создаваемые большими порами, но и выявить симметричную организацию субъединиц вокруг центрального отверстия (табл. 8.4). Общим структурным мотивом для этих белков может быть цилиндрический канал, формируемый несколькими амфифильиыми а-спиралями разных субъединиц или отдельными доменами одной субъединицы [1479]. Впрочем, структура аламетицина и грамицидина А свидетельствует о том, что боковые цепи полярных аминокислот не нужны для формирования полярной внутренней структуры заполненного водой канала. Ни в одном из случаев не доказано достоверно, что кислые остатки непосредственно участвуют в образовании поры. Важным исключением из а-спирального семейства каналов являются порины, поскольку они формируют поры из /3-слоев, а не с помощью а-спиралей.

Таблица 8.4. Псевдосимметрия некоторых пор и каналов

Пора/канал Структурная Комментарии

симметрия

Порины Симметрия 3-го Три идентичные

порядка субъедииицы

Натриевый канал Симметрия 4-го Четыре гомологичных

порядка домена единственной

субъедииицы

Канал ацетил- Симметрия 5-го Организация четырех

холииового порядка гомологичных субъ-

рецептора единиц в виде аг/Зуб

Щелевой контакт Симметрия 6-го 12 идентичных субъеди-

порядка ниц, по шесть в каж-

дой мембране

Ядерный поровый Симметрия 8-го Субъединичиый состав

комплекс порядка неизвестен

Поры, каналы и переносчики 359

8.2.1. ЩЕЛЕВЫЕ КОНТАКТЫ [871]

Щелевые контакты — это кластеры мембранных каналов, которые соединяют содержимое соседних клеток в тканях. Через такие каналы проходят небольшие молекулы — метаболиты и неорганические ионы. Диаметр каналов в клетках млекопитающих составляет от 12 до 20 А [871, 1515]. Через иих осуществляется перенос из клетки в клетку ионов и химических веществ. Таким образом, эти каналы соединяют две плазматические мембраны. Опыты по клонированию [273] и биохимической реконструкции показали, что канал образован олигомером единственного пептида, мол. масса которого для клеток печени составляет 32000 [871]. Исходя из данных об аминокислотной последовательности, можно предположить, что в каждой субъединице имеются четыре трансмембранные а-спирали [1631]. К настоящему времени охарактеризованы белки щелевых контактов (или коннексииы) из нескольких тканей; по-видимому, они образуют обширную группу родственных белков [871, 916]. Эти каналы обычно находятся в открытом состоянии, но закрываются, когда понижается скорость метаболизма [1515]. Первичным сигналом для закрывания канала является, по всей вероятности, повышение концентрации Са2 + , хотя при изменении трансмембранного потенциала или закислении среды также наблюдается закрывание канала. Возможно, эффект Са2+ является опосредованным. Другим способом регуляции работы канала может быть фосфорилирование [871].

Основная модель, описывающая строение и возможный механизм работы канала, представлена в работе [1482]. Для выяснения структуры канала авторы использовали электронную микроскопию. Каждый канал состоит из 12 субъединиц, по шесть от каждой клетки. Канал представляет собой гексамерную структуру с центральной порой. Каждая субъединица имеет форму стержня, пронизывающего бислой. Два гексамерных комплекса соседних мембран соединены конец к концу и образуют протяженный канал, объединяющий обе мембраны. Стру

страница 50
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.04.2017)