Биологический каталог




Биомембраны - Молекулярная структура и функции

Автор Р.Геннис

АНАЛИЗ СТАЦИОНАРНОГО СОСТОЯНИЯ [791, 1386, 41]

Для кинетической характеристики транспортных систем, которые катализируют облегченную диффузию или активный транспорт, могут использоваться различные подходы к анализу стационарного состояния. Все эти подходы основаны на измерении скорости переноса растворимых веществ через мембрану, но при разных условиях. В качестве примера мы рассмотрим эксперименты, которые проводились на пермеазах и мембранных везикулах. Обычно для такого рода измерений используют радиоактивные метки. Ключевым моментом является то, что пермеаза должна не только переносить вещество через бислой (цис -* транс), то также и возвращаться обратно (транс -* цис). Скорость транспорта может зависеть от любой из этих стадий. Опишем вкратце некоторые подходы к анализу.

1. Субстрат присутствует только с одной стороны мембраны (цис). Начальная скорость транспорта измеряется для однонаправленного потока. Обратите внимание, что для обеспечения постоянного потока транспортируемого вещества переносчик (пермеаза) должен вернуться свободным. Измеряют поток как функцию [S]^uf для процесса, протекающего в любом направлении (например, для переноса вещества внутрь везикул или для выведения его из везикул).

2. Равновесный обмен. Субстрат присутствует в одинаковой концентрации с обеих сторон мембраны, но радиоактивная метка — только с одной стороны (цис). В этом случае пермеаза может возвращаться, будучи связанной с немеченым веществом. Измеряют поток как функцию [S].

3. Меченый субстрат нахоится с цис-стороны мембраны, а в насыщающей концентрации он присутствует на противоположной (транс) стороне. Измеряют поток как функцию [S]^uc. Как и в первом случае, при этом регистрируют однонаправленный поток (цис -> транс). Такой поток называют также встречным, поскольку меченое вещество переносится против своего химического градиента.

4. Удельная радиоактивность субстрата с обеих сторон мембраны одинакова. В насыщающей концентрации субстрат находится на транс-стороне, a [S]„uc изменяется. В этом случае измеряют

Поры, каналы и переносчики 347

суммарный перенос, поскольку радиоактивное вещество пересекает мембрану в обоих направлениях. При таких условиях измерения состояние системы близко к равновесному.

Во всех случаях определяют Ктах и Км, которые при этом не обязательно совпадают для разных подходов. Для разных моделей можно получить кинетические уравнения для стационарного состояния и проверить их [791]. Как и в классических работах по энзимологии, очень полезным может оказаться использование ингибиторов [791, 410, 409]. При этом ингибиторы можно вводить с любой стороны мембраны, что позволяет получить дополнительную информацию.

Такого рода подходы можно применять при работе с клетками, субклеточными мембранными везикулами или искусственными реконструированными системами. Для исследования работы ионных каналов обычно применяют электрические методы, которые дают огромные преимущества. Их мы рассмотрим в следующем разделе.

Дополнение 8.2. Исследование транспорта

в стационарном состоянии с использованием мутантной лактоэопермеазы из Е. coll

Как пример использования описанных выше подходов рассмотрим изучение транспорта в стационарном состоянии, осуществляемого одной из мутантных форм лактоэопермеазы, в которой остаток Glu в положении 325 заменен на Ala ([717]; разд. 8.3.2). На рис. 8.11 этот остаток находится в спирали 10. При измерениях использовали радиоактивную лактозу, при этом накопление лактозы изучали на интактных клетках, а выведение, встречный поток и обмен лактозы — на цитоплазматических мембранных везикулах с правильной ориентацией. Пермеаза дикого типа катализирует симпорт /3-галактозидов (например, лактозы) и Н+. В присутствии протонного электрохимического градиента пермеаза использует свободную энергию, высвобождающуюся при переносе Н + по градиенту, для накопления /3-галактозидов против концентрационного градиента.

При замене остатка Glu-325 на Ala активный транспорт лактозы прекращается. Для измерения накопления лактозы использовали интактные клетки, в которых пермеаза дикого типа была заменена мутантной пермеазой. Для этого к суспензии дышащих клеток добавляли [1-14С]-лактозу и измеряли количество лактозы, накапливаемой клетками, в зависимости от времени. Приблизительно через 3 мин перенос лактозы достигал максимальной величины (50— 100 нмоль лактозы на 1 мг белка), но в клетках с мутантной перме-

348 Глава 8

азой оставался пренебрежимо малым. Для изучения выведения лактозы инкубировали мембранные пузырьки в течение нескольких часов в присутствии высоких концентраций радиоактивной лактозы, а затем аликвоты переносили в среду без лактозы. Быстро фильтровали везикулы, измеряли их радиоактивность с помощью сцин-тиляционного счетчика и определяли скорость потери лактозы везикулами. Время полувыведения для контрольных везикул составляло 10 с, а для пузырьков, содержавших мутантную пермеазу, оно было равно 540 с. Мутантная пермеаза неспособна транспортировать лактозу как в прямом, так и в обратном направлениях.

Совершенно другие результаты были получены, однако, при измерении равновесного обмена. Эти измерения проводят точно так же, как и измерения по выведению лактозы, только нагруженные лактозой везикулы помещают в среду, содержащую немеченую лактозу в такой же концентрации. В этих опытах скорости выведения [I- С]-лактозы из везикул, содержавших в одном случае пермеазу дикого типа, в другом — мутантную, были идентичными. Эти эксперименты показывают, что, хотя мутантная пермеаза не может осуществлять полный цикл транспорта лактозы, она способна изо-меризоваться в загруженную форму (связанную с лактозой и Н +), что делает возможным трансмембранный обмен лактозы (см. рис. 8.11). Сходным образом мутантная пермеаза нормально функционирует в опытах по измерению встречного потока. При таком подходе везикулы нагружают немеченой лактозой (10 мМ), разводят средой, содержащей [1-|4С]-лактозу в низкой концентрации (1,6 мМ), и измеряют поток меченой лактозы внутрь везикул. Этот подход также показал, что связанная с лактозой форма пермеазы нормально изомеризуется и осуществляет трансмембранный обмен лактозы.

Приведенные выше данные позволили сделать вывод о том, что мутантная пермеаза, содержащая А1а-325, не может депротониро-ваться. Таким образом, пермеаза оказывается дефектной по всем сопряженным транспортным процессам, в которых Н+ и лактоза переносятся вместе в цикле, требующем наличия депротонирован-ной формы переносчика для изомеризации (Ei *+ Е0 на рис. 8.11).

Другие примеры использования такого рода подходов более подробно рассмотрены в отличной книге Штейна [1386].

8.1.4. РЕГИСТРАЦИЯ ТОКА, ПРОТЕКАЮЩЕГО ЧЕРЕЗ

ОДИНОЧНЫЙ КАНАЛ: ВСТРАИВАНИЕ В ПЛОСКИЕ МЕМБРАНЫ [582, 1010] И МЕТОД ПЭТЧ-КЛАМП [24]

Электрический ток, возникающий при быстром перемещении ионов через канал, можно легко измерить. Например, реконструиро-

Поры, каналы и переносчики 349

ванный никотиновый ацетилхолиновый рецептор — химический воротный катионселективный канал в постсинаптических мембранах, открывание и закрывание которого регулируется с помощью химических веществ, — имеет проводимость в открытом состоянии 45 пСм при концентрации NaCl с одной стороны мембраны 0,5 М. Это — обычное значение проводимости для ионных каналов. При этом при напряжении на мембране 100 мВ через каждый канал проходит ток 4,5 пА, или 2,7-107 ионов/с. Этот ток легко зарегистрировать с помощью соответствующей электронной аппаратуры. Следовательно, ток через единичный канал можно прямо измерить, если фоновый ток через мембрану достаточно мал. Для того чтобы исследовать свойства индивидуальных канальных молекул, необходимо измерить ток через участок мембраны в условиях, когда одновременно открыто не более одного канала. Для этого можно использовать искусственную систему, когда в плоскую мембрану встроены одиночные канальные белки [1012, 246, 582]. Можно также воспользоваться методом пэтч-кламп [243]. В основе метода лежит сделанное в 1979 г. открытие, показавшее, что если чистую стеклянную микропипетку прижать к клеточной мембране и слегка втянуть воздух в пипетку, то на ее конце образуется очень тонкая, но прочная мембранная пленка. Это позволяет получать вольт-амперные характеристики любых каналов, находящихся на этом небольшом участке мембраны. Фоновый ток обычно бывает значительно меньше 1 пА, так что ток через индивидуальный канал можно легко измерить. Применение этой техники произвело настоящую революцию в изучении ионных каналов, позволив детально исследовать работу разнообразных каналов из различных мембран. На рис. 8.3 схематически показаны четыре модификации метода пэтч-кламп. В рамках данного метода можно изменять состав раствора как с одной, так и с обеих сторон мембраны, можно измерять проводимость единичных каналов, изучать энзимологию единичных молекул. Все это делает метод пэтч-кламп необычайно мощным.

Чтобы оценить возможности данного подхода, рассмотрим запись работы единичного ацетилхолинового рецепторного канала (рис. 8.4), встроенного в бислой [1012] (см. рис. 2.26). Ворота индивидуальных каналов могут спонтанно открываться и закрываться. Каждое отклонение записи вниз соответствует открыванию канала. Ток, текущий через открытый канал, можно измерить, а это дает возможность определить проводимость единичного канала (ток/ напряжение). Время, в течение которого каждый канал остается открытым, также легко измерить. Получаемое при этом распределение времени жизни канала в открытом состоянии прямо связано с константой скорости закрывания канала. Для самой простой модели, когда имеется одно открытое (О) и одно закрытое (С) состояние,

350 Глава 8

Рис. 8.3. Четыре варианта пэтч-кламп-регистрации [243]. А. Кончик пипетки плотно прижимают к клеточной мембране и проводят регистрацию от интактиой клетки. Б. При отведении пипетки кусочек мембраны отрывается от клетки и оказывается прочно связанным с кончиком пипетки. Сторона мембраны, ранее обращенная к цитоплазме, теперь обращена во внешнюю среду (конфигурация "inside-out"). В. При слабом втягивании воздуха в пипетку целостность мембраны под кончиком пипетки нарушается и создается конфигурация, позволяющая проводить измерения иа целой клетке. Г. При медленном отведении пипетки От клетки иа копчике пипетки остается участок мембраны правильной ориентации ("outside-out").

[ACh] = 0,1 мкМ Закрыт tjttmMrmsmWtom I'mil»

Т

Открыт '

Попит ч^тум*****

30 пс j 10 мс

i

и*

(ACh] ЮмкМ

Закрь/т ^

Отнрь'т

Ы^&л^М ^^^^^^^^^

- И*» I i *d

^л^-^мШтХ А Мв1ввк^1аввШваМа1ая\Ш

Рис. 8.4. Запись электрического тока через единичный канал ацетилхолииового рецептора, активированный ацетилхолином (ACh, 0,1 или 10 мкМ) при напряжении 100 мВ [805]. Канал был встроен в плоскую мембрану на конце пипеткн (см. рис. 2.26). Раствор по обе стороны мембраны содержал 0,5 М NaCl. Приводится с разрешения Society for Neuroscience. Любезно предоставлено д-ром М. Montal.

Поры, каналы и переносчики 351

Op С, k-i

распределение времени жизни канала описывается экспоненциальной функцией с характерным временем т, равным величине, обратной константе скорости первого порядка для закрывания канала (ti = \/k-i). Когда функция распределения времени жизни канала в открытом состоянии отличается от простой экспоненциальной зависимости, как в случае ацетилхолииового рецептора [1012], для объяснения экспериментальных данных необходимо использовать более сложные состояния. Можно изучать влияние на работу канала различных химических агентов; при этом необходимо отличать влияние этих агентов на кинетические параметры открывания-закрывания каналов от их влияния на проводимость одиночных каналов.

Дополнение 8.3. Определение константы

связывания ингибитора по данным о проводимости единичного канала

Рассмотрим использование данных о проводимости единичного канала на примере исследования взаимодействия харибдотоксина с Са2 +-активируемым К +-специфичным каналом [1358]. Харибдоток-син, небольшой пептид, выделенный из скорпионов, является эффективным ингибитором этого канала. Биохимические характеристики канала не изучены, однако его работу интенсивно исследовали, используя технику регистрации тока через одиночные каналы. Для этого вначале готовили мембранные везикулы из поперечных волокон скелетных мышц крысы и проводили их слияние с плоским липидным бислоем (гл. 2). На рис. 8.5 приведены записи электрического тока через единичный канал, быстро переходящий из открытого состояния в закрытое. Если эти данные представить в милли-секундном масштабе, то можно будет увидеть отдельные акты срабатывания канала, как это показано на рис. 8.4.

При добавлении харибдотоксина в работе канала появляются длительные периоды, в течение которых он остается в непроводящем состоянии. Очевидно, связывание токсина каким-то образом блокирует канал. Частота появления этих «мертвых» периодов позволяет определить скорость связывания харибдотоксина с каналом; время, в течение которого каналы остаются закрытыми, зависит от константы скорости диссоциации комплекса канал—токсин.

^связ [ТОКСИН]

Активный канал + Токсин -* Неактивный канал—токсин.

^дисс

352 Глава 8

Контроль

\М\\.Щ\Щ II ll.ljifi ijliiHHW^|li>llli)||IIIHfP

. lilt i*lni«i»

'tfflf-ll,f'1'

2 нм хт

BiViiii "\ щ iii

35 нМ XT

u

0,00

5 10 15

Концентрация тарибдотонсина, н м

Рис. 8.5. Влияние харибдотоксииа иа Са2 + -активируемые К + -каналы из мембран скелетных мыши крысы. А. Запись тока через одиночный канал. Прн таком временнбм масштабе акты открывания/закрывания канала не выявляются, как это было на рис. 8.4. Добавление харибдотоксииа (XT) приводит к длительной инактивации канала. Б. Зависимость величин, обратных времени жизни канала в активном или неактивном состояниях, от концентрации токсина. Рисунок любезно предоставлен С. Miller.

Среднее время жизни канала в активном состоянии т\ обратно пропорционально скорости связывания токсина, а время жизни его в закрытом состоянии т - i — скорости диссоциации:

(1/т,) = Аг^з [Токсин],

(1/7- i) = Адисс-

Данные, представленные на рис. 8.5, показывают, что скорость блокирования канала зависит от концентрации токсина, а скорость диссоциации не зависит от концентрации свободного токсина.

Из этих данных легко получить как Агдисс, так и Агсвяз для токсина; их отношение дает константу диссоциации (Kd = 3,5 нМ). Замечательно, что получаемые параметры — как кинетические, так и

Поры, каналы и переносчики 353

термодинамические — относятся к событиям, происходящим с индивидуальной молекулой.

8.1.5. НЕБОЛЬШИЕ МОЛЕКУЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ МОДЕЛЕЙ КАНАЛОВ И ПОР '

Кинетические методы, кратко описанные в предыдущем разделе, используются для анализа работы различных каналов и переносчиков, обнаруживаемых в биомембранах. Расшифрована аминокислотная последовательность многих из этих белков. Однако, как уже отмечалось в гл. 3, до сих пор не удалось провести рентгеноструктурные исследования с высоким разрешением ни для одного из этих транспортных белков, поэтому при изучении структуры и

страница 49
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Биомембраны - Молекулярная структура и функции" (4.40Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.10.2017)